CHIEDI DI PIÙ AI TUOI DATI DI SEQUENZIAMENTO: APPROCCI INNOVATIVI DI BIOLOGIA MOLECOLARE NEL BIORISANAMENTO

Introduzione e obiettivi di studio: Il biorisanamento si basa sulla naturale capacità dei microrganismi di trasformare i contaminanti ambientali utilizzandoli come substrato di crescita e fonte di energia. Per la sua applicazione è quindi necessario determinare il potenziale biodegradativo della comunità autoctona della matrice contaminata, valutando la presenza di specifiche capacità metaboliche legate alla rimozione degli inquinanti. Questo è fondamentale in fase di caratterizzazione per la scelta della tecnica di bonifica sito-specifica più idonea e, durante il monitoraggio, per analizzare l’evoluzione delle condizioni microbiologiche del sito, nel tempo, valutando l’efficacia dell’intervento selezionato. A tale scopo, l'approccio biomolecolare risulta il più efficace; tramite l’utilizzo di tecniche di biologia molecolare, infatti, è possibile descrivere la struttura della comunità microbica e le sue specifiche funzioni metaboliche. Ad oggi, le tecniche maggiormente utilizzate sono in grado di fornire informazioni quantitative o qualitative, che risultano complementari e richiedono, quindi, un’ integrazione dei dati ottenuti. In particolare, la PCR quantitativa (qPCR) consente la quantificazione assoluta di specifici geni tassonomici e catabolici che vengono utilizzati come biomarcatori di determinati gruppi microbici e/o metabolici. Parallelamente, tramite il sequenziamento ad alta processività (Next-Generation Sequencing - NGS) dei marcatori tassonomici è possibile individuare e classificare i gruppi microbici presenti nel campione ambientale. Il sequenziamento NGS ha la grande potenzialità di descrivere nel dettaglio la presenza di popolazioni microbiche, ma ne stima unicamente l’abbondanza relativa e non quella assoluta nel campione. In quest’ottica, risulta di interesse implementare e ottimizzare tali strategie analitiche al fine di ottenere un’informazione completa in un’unica metodologia, riducendo, in questo modo, tempi e costi dell’analisi. Metodologia Le analisi microbiologiche-molecolari prevedono il prelievo dei campioni ambientali dal sito e l’estrazione del DNA genomico da essi. Per l’analisi della comunità batterica, il DNA genomico è amplificato con una coppia di primer specifica per il frammento genico corrispondente alle regioni ipervariabili V5-V6 del gene 16S rRNA batterico. Il sequenziamento è effettuato mediante piattaforma Illumina MiSeq. Le sequenze ottenute (.fastQ) sono elaborate per definire le unità tassonomiche operative (OTU) e la loro abbondanza in ciascun campione. Successivamente, le OTU sono classificate tassonomicamente utilizzando il database RDP (Ribosomal Database Project). Partendo dall’analisi di sequenziamento, sono state sviluppate due metodiche analitiche innovative: • Analisi funzionale dei dati di sequenziamento; • Quantum sequencing (q-SEQ). Tramite l’analisi funzionale è possibile attribuire ai generi batterici individuati una o più capacità metaboliche di biodegradazione di inquinanti organici sulla base della presenza dei determinanti genetici di queste capacità nei genomi depositati nelle banche dati. Questo permette di stimare l’abbondanza relativa dei batteri degradatori di specifici contaminanti nei campioni. Il q-SEQ è, invece, un’evoluzione del sequenziamento NGS che consente di ottenere in una sola analisi sia il dato qualitativo, e quindi la classificazione tassonomica, che il dato quantitativo assoluto di abbondanza microbica. Questo consente di combinare in un’unica analisi le informazioni del sequenziamento NGS e della qPCR e, conseguentemente, di ridurre i tempi necessari e aumentare la risoluzione e la sensibilità delle analisi. Il metodo si basa sull’utilizzo di sonde geniche aggiunte a quantità note come standard interni (ISG) prima del sequenziamento. È possibile sviluppare questa metodica su diversi geni sia metabolici che catabolici, consentendo l’adattabilità di tale metodo alle diverse esigenze sito-specifiche. Risultati e conclusioni La determinazione del potenziale biodegradativo della comunità autoctona della matrice contaminata risulta fondamentale nelle varie fasi del processo di bonifica ed è quindi cruciale sviluppare nuovi strumenti per spingersi sempre più a fondo nella sua comprensione. L’analisi funzionale e il q-SEQ rappresentano due strumenti innovativi e promettenti per il miglioramento dell’interpretazione dei dati di sequenziamento, migliorando sensibilità e risoluzione dell’analisi, specialmente per apprezzare le differenze tra campioni e tra tempi di campionamento diversi, monitorando l’evoluzione della comunità microbica nel tempo.