Proteomic characterization of the role of FUS/TLS in human cells: from pre-mRNA splicing to DNA damage response

FUS (anche nota come TLS) è una RNA-binding protein espressa in maniera ubquitaria nelle cellule umane, che è stata descritta essere fusa a fattori di trascrizione in alcuni sarcomi ed è presente in aggregati proteici nei neuroni di pazienti affetti da forme ereditarie di Sclerosi Laterale Amiotrofica. FUS è stata coinvolta in numerosi processi cellulari, come l’espressione genica, la regolazione trascrizionale, il pre-mRNA splicing, e il processamento dei miRNA. In più, è stata coinvolta nella risposta al danno al DNA e in particolare è stato dimostrato che rilocalizza ai siti di danno nelle fasi precoci della risposta. Inoltre, a seguito di danno al DNA, FUS agisce come SUMO E3 ligasi per la proteina EBP1, mediandone la sumoilazione, una modifica post-traduzionale necessaria alla sua attività onco-soppressiva. L’esatta funzione di FUS in questi processi non è ancora stata chiarita, quindi, per elucidare la sua attività abbiamo studiato il suo interattoma, in cellule umane, in condizioni basali e a seguito di stress genotossico. Gli interattori di FUS sono stati isolati tramite immunoprecipitazione su estratti proteici totali di cellule HEK293T esprimenti FUS-flag ricombinante, in tre condizioni diverse: con e senza trattamento degli estratti con RNAsi e con trattamento e lavaggio ad alta concentrazione salina. Gli interattori sono stati identificati tramite spettrometria di massa, con i seguenti risultati: 546 proteine nei campioni non trattati, 134 nei trattati, 53 nei trattati con alto sale; 40 proteine sono state identificati in comune a tutte e tre le condizioni e possono essere considerate gli interattori di FUS più conservati. Questi ultimi sono proteine annotate soprattutto a processi biologici associati all’RNA, in linea con i ruoli già descritti di FUS nel metabolismo dell’RNA; in questo set di proteine sono presenti HNRNPs, RNA elicasi, fattori di splicing, e proteine regolatorie della trascrizione. In particolare, tra gli interattori più conservati, c’è un arricchimento in proteine facenti parte del complesso spliceosomale minore di tipo U12. L’interazione di FUS con queste proteine è stata validata ed esperimenti funzionali di splicing hanno dimostrato che FUS lega gli introni di tipo U12 aumentandone lo splicing. Inoltre, sono stati identificate tra gli interattori di FUS proteine coinvolte nella risposta e riparazione dei danni al DNA (DDR), tra cui Ku70, Ku80, PSF, p54, PARP1, e altre. Pertanto, per caratterizzare il ruolo di FUS nella DDR è stata condotta un’analisi di interattoma a seguito di stress genotossico. Cellule HEK293T esprimenti FUS-flag sono state trattate con Etoposide per generare rotture a doppio-filamento del DNA ed gli interattori identificati a seguito di immunoprecipitazione e spettrometria di massa quantitativa. L’analisi ha restituito una lista di interattori la cui affinità per FUS era aumentata o diminuita a seguito del danno. In particolare, la maggior parte delle proteine con un’aumentata affinità hanno la capacità di legare gli acidi nucleici, in particolare l’RNA. Recentemente, le RNA-binding proteins, sono state descritte come i principali regolatori della DDR. Inoltre, alcune di queste sono state descritte come sumoilate e ciò potrebbe suggerire un ruolo di FUS come E3 ligasi nella DDR. Tuttavia, l’esatto ruolo di FUS nella DDR deve ancora essere chiarito, e i nostri risultati suggeriscono che potrebbe giocare un ruolo nella regolazione dell’espressione dei geni delle proteine coinvolte nella DDR, tramite la sua attività di splicing, o funzionare come proteina di supporto per reclutare RNA-binding proteins al sito di danno al DNA.