PET imaging as a biomarker of tumor response to therapy

Molecular imaging allows the non-invasive visualization and characterization of biological processes. It can be used in oncology to identify biomarkers for the evaluation of tumor progression and response to therapy. In this thesis work, the animal PET was used as potential biomarker of tumor response to therapy focusing on altered metabolism and hypoxia in a) a model of oncogenic k-ras and b) in a model of glioma. Metabolic alterations, such as increased glycolysis and glutamine consumption, are associated with mutations in k-ras gene. The decoupling of glucose and glutamine uptake leads to a reprogramming of their metabolism to support cell proliferation representing a target for cancer therapy. The aim of this study is to investigate metabolic alterations in k-ras transformed fibroblasts (NIH-RAS) in in vivo studies and to assess response to therapy. Animals subcutaneously implanted with NIH-RAS performed [18F]FDG- and [18F]FLT-PET at several time points to evaluate glucose metabolism and cell proliferation, respectively. Tumors were collected and evaluated for different markers by immunohistochemistry (IHC) to confirm in vivo results. In the same model, the efficacy of chloroquine (autophagy blocker) and BPTES (glutaminase inhibitor) alone or in combination was monitored by [18F]FDG- and [18F]FLT-PET before and 48 hours after treatments. All animals developed fast growing and highly glycolytic tumors in few days that appear homogeneous for both [18F]FDG and [18F]FLT uptake. PET imaging showed a significant increase in [18F]FDG uptake while cell proliferation remained stable over time, as depicted by [18F]FLT uptake. IHC analyses confirmed the high aggressiveness of these cells. Chloroquine and BPTES combined treatment slowed down tumor growth only if compared to vehicle, without affecting glucose metabolism or cell proliferation. The presence of alternative pathways for glutamate production and the need of higher doses of treatments may provide explanations to the lack of treatments’ efficacy. Hypoxia is implicated in many aspects of tumor progression and it is involved in the intracellular stabilization of the hypoxia regulator gene HIF-1α. Since the expression of HIF-1α is associated with poor prognosis and therapy resistance in glioblastoma, a better comprehension of its involvement in tumor response to treatment can be of great interest for clinical translation. U251-HRE-mCherry cells expressing Luciferase under control of a Hypoxia Responsive Element (HRE) and mCherry under the control of a constitutive promoter have been used to assess HIF-1α modulation and cell survival after treatment, both in vitro and in vivo. In vivo analyses characterized the model obtained by stereotaxic injection of glioma U251-HRE cells in mice brain. Tumor progression was monitored comparing bioluminescence, fluorescence and PET with [18F]FAZA and [18F]FLT. Afterwards, two regimens of temozolomide (TMZ) were administered starting 21 days after cells injection. TMZ efficacy was monitored by optical and fluorescence imaging, [18F]FLT-PET and MRI. Bioluminescent signals provided information about tumor growth and hypoxia presence, confirmed by both fluorescence acquisition and [18F]FAZA PET. IHC for Ki67 confirmed data obtained by [18F]FLT-PET, showing a high rate of cell proliferation. Both TMZ regimens showed a decrease of HIF-1α-dependent Luciferase activity at early time after TMZ administration. On the contrary, mCherry fluorescence, such as [18F]FLT uptake, decreased only at the end of treatments. HIF-1α activity reduction can be considered a biomarker of tumour response to TMZ and the U251-HRE-mCherry cell model a feasible tool to evaluate HIF-1α activity and treatment effects in in vivo studies.

Le tecniche di imaging molecolare permettono di visualizzare e caratterizzare processi biologici e rivestono un ruolo fondamentale in oncologia, consentendo di identificare marcatori per la diagnosi e la risposta al trattamento. In questo lavoro di tesi è stato valutato il ruolo della PET come possibile marcatore di risposta al trattamento in a) un modello con k-ras oncogenico e b) un modello di glioma, focalizzando l’attenzione sulle alterazioni del metabolismo e l’ipossia. L’incremento della glicolisi e del consumo di glutammina sono associati a mutazioni dell’oncogene ras in diversi tumori. Il disaccoppiamento di tali processi determina una riprogrammazione del metabolismo per supportare l’aumentata proliferazione fornendo un interessante target terapeutico. Scopo dello studio è la valutazione in vivo delle alterazioni metaboliche e della risposta alla terapia nel modello ottenuto mediante inoculo di fibroblasti con k-ras oncogenico (NIH-RAS). A tale scopo gruppi di topi sono stati monitorati longitudinalmente mediante PET-[18F]FDG e [18F]FLT per la valutazione del metabolismo glucidico e della proliferazione cellulare. I tumori sono stati sottoposti ad analisi immunoistochimiche per confermare i dati ottenuti in vivo. Nello stesso modello è stato valutato l’effetto di un inibitore dell’autofagia (Clorochina) e della glutaminasi (BPTES) singolarmente e in combinazione mediante PET-[18F]FDG e [18F]FLT. Gli animali hanno sviluppato in breve tempo tumori glicolitici e caratterizzati da un’omogenea captazione di [18F]FDG e [18F]FLT. Le immagini PET hanno mostrato un aumento della captazione di [18F]FDG nel tempo e un andamento stabile della proliferazione come mostrato dalla costante captazione di [18F]FLT. Clorochina e BPTES in combinazione hanno determinato un rallentamento della crescita tumorale rispetto ai controlli, ma non sono state osservate variazioni nella captazione di [18F]FDG e [18F]FLT. La presenza di vie alternative per la produzione di glutammato e la necessità di dosi più elevate potrebbero spiegare l’assenza di efficacia di questi trattamenti. L’ipossia rappresenta un fenomeno sfavorevole per la progressione tumorale. L’espressione di HIF1α, principale regolatore dell’ipossia, è associata alla resistenza alla terapia in molti tumori, compreso il glioma. Per questo, una migliore comprensione della modulazione dell’attività di HIF1α nel processo di risposta alla terapia è di particolare interesse. Cellule di glioma U251-HRE-mCherry in grado di esprimere l’enzima luciferasi sotto il controllo di HRE (Hypoxia Responsive Element) e mCherry sotto controllo di un promotore costitutivo sono state utilizzate per valutare la modulazione di HIF1α in seguito a trattamento con Temozolomide (TMZ) in vitro e in vivo. La crescita tumorale è stata monitorata in vivo in animali sottoposti ad inoculo intracerebrale tramite bioluminescenza, fluorescenza, RM e PET con [18F]FAZA e [18F]FLT. In seguito, è stato valutato in vivo l’effetto di due diversi regimi di TMZ. Mediante bioluminescenza è stato possibile monitorare la crescita tumorale e identificare aree ipossiche. I dati ottenuti sono stati confermati dalle immagini di fluorescenza e PET-[18F]FAZA. Le analisi ex vivo per Ki67 hanno invece confermato i dati PET-[18F]FLT ed hanno mostrato un’elevata proliferazione cellulare. Entrambi i dosaggi di TMZ hanno determinato una diminuzione dell’attività di HIF1α a tempi precoci. Al contrario, il segnale di fluorescenza e la captazione di [18F]FLT hanno subìto una diminuzione solo a tempi più tardivi. L’attività di HIF1α può essere considerata un marcatore di risposta al TMZ e questo modello un utile strumento per la valutazione in vivo di farmaci per il trattamento del glioma.