Le proteine Ras sono proteine G monomeriche, a basso peso molecolare e dotate di una bassa attività GTPasica intrinseca che svolgono un ruolo chiave nelle vie di trasduzione del segnale coinvolte in processi di crescita e differenziamento cellulare. Ras può funzionare come un vero e proprio interruttore molecolare, trovandosi alternativamente in due stati: uno attivo (legato a GTP) ed uno inattivo (legato a GDP). I passaggi dallo stato attivo a quello inattivo e viceversa possono avvenire spontaneamente, ma la velocità delle due reazioni in questo caso sarebbe molto bassa. Per questo motivo l’attività di Ras è regolata da due classi di proteine. Le proteine GAP (GTPase Activating Protein) sono in grado di catalizzare una più efficiente idrolisi del nucleotide da GTP a GDP, portando all’inattivazione di Ras. I GEF (Guanine nucleotide Exchange Factors), invece, sono in grado di favorire la dissociazione del nucleotide idrolizzato ed il conseguente scambio GDP/GTP, contribuendo alla modulazione positiva del pathway. Varianti mutate dei geni ras sono state identificate con alta incidenza in molteplici forme di patologie tumorali. Per tale ragione le proteine Ras sono considerate target molecolari d’eccellenza nella terapia di disordini proliferativi. Nel nostro laboratorio è stato dimostrato come una singola sostituzione amminoacidica all’interno del GEF Ras-specifico Cdc25Mm sia in grado di convertire lo stesso in una proteina dotata di proprietà dominanti negative, capace di inibire specificamente l’attività di Ras in vitro e di attenuarne il circuito di segnalazione in vivo, diminuendo il potenziale oncogenico di fibroblasti murini trasformati dall’oncogene k- ras. Inoltre, recentemente abbiamo dimostrato come anche singoli peptidi isolati dall’intero GEF (derivati dalle zone recanti le mutazioni puntiformi di cui sopra) mantengano, almeno parzialmente tali proprietà. Scopo della presente tesi è lo sviluppo di peptidi derivati del GEF Cdc25Mm come agenti Ras inibitori e la loro validazione in linee cellulari di tumore alla vescica. Considerato il meccanismo d'azione di tali peptidi, un requisito fondamentale per il loro funzionamento nei modelli cellulari d'interesse è la presenza di una correlazione tra il fenotipo trasformato di quest'ultimi e lo stato di attivazione di Ras. Dal momento che dati di letteratura suggeriscono un coinvolgimento del fattore di crescita IGF-I nelle patologie tumorali della vescica e dato il noto collegamento tra tale fattore di crescita ed il pathway di Ras, abbiamo inizialmente analizzato gli effetti della stimolazione da IGF-I su due linee cellulari derivate da carcinoma alla vescica (5636 e T24). Sorprendentemente tale fattore di crescita non ha evidenziato grandi effetti sul potenziale proliferativo delle linee oggetto di studio, rivelandosi tuttavia estremamente efficace nello stimolare una aumentata motilità cellulare, come evidenziato da saggi di migrazione, invasione e wound-healing. A livello molecolare tali effetti sono accompagnati da un forte innalzamento dei livelli di Ras•GTP e dalla successiva attivazione delle vie di segnalazione a valle di Ras, come MAPK e AKT. La stimolazione da IGF-I è inoltre in grado di determinare la fosforilazione e l'attivazione di Paxillina (una proteina adattatrice nota per il suo importante ruolo nei fenomeni di migrazione cellulare) e la sua colocalizzazione con FAK (Focal Adhesion Kinase) a livello dei punti di adesione focale. Infine, tale attivazione di Paxillina, così come l'aumentata motilità cellulare indotta da IGF-I, risulta essere dipendente, in modo diretto o indiretto, dall'attività di MAPK e AKT. L'utilizzo di inibitori chimici di suddette vie o di siRNA specifici per le suddette chinasi in grado di regolarne negativamente l'espressione è in grado di attenuare infatti gli effetti indotti da IGF-I sia a livello biochimico sia a livello fenotipico. Nel complesso, questi dati evidenziano come il pathway dell'IGF-I sia di fondamentale importanza nella regolazione della motilità in cellule tumorali di vescica, fenomeno strettamente collegato al potenziale metastatico. Questi stessi dati suggeriscono inoltre l'importanza per questi stessi fenomeni di due vie di trasduzione parallele (MAPK e AKT), la cui attivazione potrebbe tuttavia essere guidata da un unico segnale a monte, ovvero l'innalzamento dei livelli di Ras•GTP. Per questo motivo lo sviluppo di molecole Ras inibitorie altamente specifiche, in grado di attenuare il circuito di segnalazione a monte di entrambe le suddette vie, potrebbe risultare di enorme interesse per il trattamento della patologia in esame. Per questo motivo abbiamo esplorato la possibilità di migliorare le proprietà farmacocinetiche e farmacodinamiche dei peptidi derivati da Cdc25Mm e dotati di proprietà Ras sequestranti. Allo scopo di ottenere una migliore veicolabilità in cellula, ad esempio, tali peptidi sono stati ingegnerizzati tramite l'aggiunta della sequenza responsabile delle proprietà auto-penetranti della proteina Tat. Tale sequenza (PTD, Protein-Transduction-Domain, aa 47-57 YGRKKRRQRRR) è costituita prevalentemente da aminoacidi carichi positivamente ed è in grado di veicolare l’internalizzazione di molteplici proteine, fungendo da carrier. Abbiamo innanzitutto dimostrato, tramite saggi di transattivaizone fos-luciferasici, come l'aggiunta di tale dominio non alteri in maniera significativa le proprietà inibitorie dei peptidi di partenza e come tali peptidi siano in grado di essere effettivamente internalizzati da cellule di mammifero (fibroblasti murini NIH3T3) qualora somministrati nel mezzo di coltura. Successivamente la ricerca è proseguita con l'ottenimento di varianti più piccole dei peptidi in oggetto, presumibilmente dotate di migliori proprietà farmacocinetiche e facilmente sintetizzabili a livello industriale. È stato quindi effettuato un design struttura-guidato, sulla base degli elementi di struttura primaria e secondaria maggiormente coinvolti nell’interazione Ras•GEF. Le varianti minimizzate sono state quindi selezionate sulla base delle proprietà Ras inibitorie misurate tramite saggi di transattivazione fos-luciferasici ed i candidati più promettenti ottenuti tramite sintesi chimica. Dato il ruolo cruciale emerso a carico delle vie di trasduzione a valle di Ras nei fenomeni di migrazione ed invasioni stimolati dalla presenza di IGF-I in linee cellulari di vescica, tali peptidi sono stati testati in saggi di migrazione ed invasione nei modelli cellulari caratterizzati precedentemente. Tutti i peptidi Ras inibenti, anche se con intensità diversa, si sono rivelati estremamente attivi nel ridurre l'aumentata motilità indotta da IGF-I delle cellule in esame a concentrazioni sub-μM.

(2009). Development of Cdc25Mn derivatives as anticancer agents. (Tesi di dottorato, Università degli Studi di Milano-Bicocca, 2009).

Development of Cdc25Mn derivatives as anticancer agents

METALLI, DAVID
2009-12-15

Abstract

Le proteine Ras sono proteine G monomeriche, a basso peso molecolare e dotate di una bassa attività GTPasica intrinseca che svolgono un ruolo chiave nelle vie di trasduzione del segnale coinvolte in processi di crescita e differenziamento cellulare. Ras può funzionare come un vero e proprio interruttore molecolare, trovandosi alternativamente in due stati: uno attivo (legato a GTP) ed uno inattivo (legato a GDP). I passaggi dallo stato attivo a quello inattivo e viceversa possono avvenire spontaneamente, ma la velocità delle due reazioni in questo caso sarebbe molto bassa. Per questo motivo l’attività di Ras è regolata da due classi di proteine. Le proteine GAP (GTPase Activating Protein) sono in grado di catalizzare una più efficiente idrolisi del nucleotide da GTP a GDP, portando all’inattivazione di Ras. I GEF (Guanine nucleotide Exchange Factors), invece, sono in grado di favorire la dissociazione del nucleotide idrolizzato ed il conseguente scambio GDP/GTP, contribuendo alla modulazione positiva del pathway. Varianti mutate dei geni ras sono state identificate con alta incidenza in molteplici forme di patologie tumorali. Per tale ragione le proteine Ras sono considerate target molecolari d’eccellenza nella terapia di disordini proliferativi. Nel nostro laboratorio è stato dimostrato come una singola sostituzione amminoacidica all’interno del GEF Ras-specifico Cdc25Mm sia in grado di convertire lo stesso in una proteina dotata di proprietà dominanti negative, capace di inibire specificamente l’attività di Ras in vitro e di attenuarne il circuito di segnalazione in vivo, diminuendo il potenziale oncogenico di fibroblasti murini trasformati dall’oncogene k- ras. Inoltre, recentemente abbiamo dimostrato come anche singoli peptidi isolati dall’intero GEF (derivati dalle zone recanti le mutazioni puntiformi di cui sopra) mantengano, almeno parzialmente tali proprietà. Scopo della presente tesi è lo sviluppo di peptidi derivati del GEF Cdc25Mm come agenti Ras inibitori e la loro validazione in linee cellulari di tumore alla vescica. Considerato il meccanismo d'azione di tali peptidi, un requisito fondamentale per il loro funzionamento nei modelli cellulari d'interesse è la presenza di una correlazione tra il fenotipo trasformato di quest'ultimi e lo stato di attivazione di Ras. Dal momento che dati di letteratura suggeriscono un coinvolgimento del fattore di crescita IGF-I nelle patologie tumorali della vescica e dato il noto collegamento tra tale fattore di crescita ed il pathway di Ras, abbiamo inizialmente analizzato gli effetti della stimolazione da IGF-I su due linee cellulari derivate da carcinoma alla vescica (5636 e T24). Sorprendentemente tale fattore di crescita non ha evidenziato grandi effetti sul potenziale proliferativo delle linee oggetto di studio, rivelandosi tuttavia estremamente efficace nello stimolare una aumentata motilità cellulare, come evidenziato da saggi di migrazione, invasione e wound-healing. A livello molecolare tali effetti sono accompagnati da un forte innalzamento dei livelli di Ras•GTP e dalla successiva attivazione delle vie di segnalazione a valle di Ras, come MAPK e AKT. La stimolazione da IGF-I è inoltre in grado di determinare la fosforilazione e l'attivazione di Paxillina (una proteina adattatrice nota per il suo importante ruolo nei fenomeni di migrazione cellulare) e la sua colocalizzazione con FAK (Focal Adhesion Kinase) a livello dei punti di adesione focale. Infine, tale attivazione di Paxillina, così come l'aumentata motilità cellulare indotta da IGF-I, risulta essere dipendente, in modo diretto o indiretto, dall'attività di MAPK e AKT. L'utilizzo di inibitori chimici di suddette vie o di siRNA specifici per le suddette chinasi in grado di regolarne negativamente l'espressione è in grado di attenuare infatti gli effetti indotti da IGF-I sia a livello biochimico sia a livello fenotipico. Nel complesso, questi dati evidenziano come il pathway dell'IGF-I sia di fondamentale importanza nella regolazione della motilità in cellule tumorali di vescica, fenomeno strettamente collegato al potenziale metastatico. Questi stessi dati suggeriscono inoltre l'importanza per questi stessi fenomeni di due vie di trasduzione parallele (MAPK e AKT), la cui attivazione potrebbe tuttavia essere guidata da un unico segnale a monte, ovvero l'innalzamento dei livelli di Ras•GTP. Per questo motivo lo sviluppo di molecole Ras inibitorie altamente specifiche, in grado di attenuare il circuito di segnalazione a monte di entrambe le suddette vie, potrebbe risultare di enorme interesse per il trattamento della patologia in esame. Per questo motivo abbiamo esplorato la possibilità di migliorare le proprietà farmacocinetiche e farmacodinamiche dei peptidi derivati da Cdc25Mm e dotati di proprietà Ras sequestranti. Allo scopo di ottenere una migliore veicolabilità in cellula, ad esempio, tali peptidi sono stati ingegnerizzati tramite l'aggiunta della sequenza responsabile delle proprietà auto-penetranti della proteina Tat. Tale sequenza (PTD, Protein-Transduction-Domain, aa 47-57 YGRKKRRQRRR) è costituita prevalentemente da aminoacidi carichi positivamente ed è in grado di veicolare l’internalizzazione di molteplici proteine, fungendo da carrier. Abbiamo innanzitutto dimostrato, tramite saggi di transattivaizone fos-luciferasici, come l'aggiunta di tale dominio non alteri in maniera significativa le proprietà inibitorie dei peptidi di partenza e come tali peptidi siano in grado di essere effettivamente internalizzati da cellule di mammifero (fibroblasti murini NIH3T3) qualora somministrati nel mezzo di coltura. Successivamente la ricerca è proseguita con l'ottenimento di varianti più piccole dei peptidi in oggetto, presumibilmente dotate di migliori proprietà farmacocinetiche e facilmente sintetizzabili a livello industriale. È stato quindi effettuato un design struttura-guidato, sulla base degli elementi di struttura primaria e secondaria maggiormente coinvolti nell’interazione Ras•GEF. Le varianti minimizzate sono state quindi selezionate sulla base delle proprietà Ras inibitorie misurate tramite saggi di transattivazione fos-luciferasici ed i candidati più promettenti ottenuti tramite sintesi chimica. Dato il ruolo cruciale emerso a carico delle vie di trasduzione a valle di Ras nei fenomeni di migrazione ed invasioni stimolati dalla presenza di IGF-I in linee cellulari di vescica, tali peptidi sono stati testati in saggi di migrazione ed invasione nei modelli cellulari caratterizzati precedentemente. Tutti i peptidi Ras inibenti, anche se con intensità diversa, si sono rivelati estremamente attivi nel ridurre l'aumentata motilità indotta da IGF-I delle cellule in esame a concentrazioni sub-μM.
VANONI, MARCO ERCOLE
Ras, GEF, CDC25Mm, RASGRF1, Bladder, Cancer, Peptides, AKT, MAPK, signal transduction
BIO/10 - BIOCHIMICA
English
Scuola di dottorato di Scienze
BIOTECNOLOGIE INDUSTRIALI - 15R
22
2008/2009
(2009). Development of Cdc25Mn derivatives as anticancer agents. (Tesi di dottorato, Università degli Studi di Milano-Bicocca, 2009).
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