HYPOTONIC STRESS-INDUCED CALCIUM SIGNALLING IN S. CEREVISIAE INVOLVES A NEW FUNGAL SPECIFIC FAMILY OF TRP-LIKE TRANSPORTERS, HOMOLOGOUS TO HUMAN MUCOLIPIN AND POLYCYSTIC KIDNEY DISEASE RELATED (PKD2) CALCIUM CHANNELS

Studi presenti in letteratura hanno dimostrato che nel lievito S.cerevisiae lo stress generato dallo shock ipotonico induce un aumento transiente della [Ca2+]i. Dai nostri studi risulta che lo shock ipotonico è mediato, in cellule cresciute in terreno ricco, da due componenti cineticamente distinte, una molto rapida (circa 5 secondi), leggermente inibita da calcio e dipendente dal calcio extracellulare, e l’altra più lenta (10-20 sec.), fortemente sensibile alla presenza di calcio nell’ambiente esterno, al punto da non essere rilevabile anche a concentrazioni extracellulari di 1 µM. Mentre la prima risposta sembra essere mediata da un trasportatore localizzato sulla membrana plasmaticala seconda è chiaramente dipendente da un rilascio dagli store intracellulari. Alcuni dati presenti in letteratura sui geni regolati dal calcio ci hanno suggerito di studiare il ruolo nella risposta a shock ipotonico di due geni omologhi, di cui il primo è stata proposto come codificante per un putativo canale per ioni simile ai canali TRP di mammifero: YOR365C e FLC2. Flc2 è localizzata sulle membrane plasmatica, di Golgi ed ER ed è stato proposto come putativo trasportatore di flavine assieme ai suoi omologhi Flc1 e Flc3. Tuttavia Flc2 era già stato precedentemente identificato come un omologo del canale del calcio pkd2 di S. pombe. Effettivamente in base a nostri allineamenti è risultato evidente come Flc2 appartenga a una sottofamiglia di canali TRP-like tipica dei funghi, a cui appartengono anche le mucolipine umane e le proteine spray fungine, ma non le proteine Pkd2. Solo la mancanza di FLC2 abbatteva completamente il rilascio di calcio dagli store intracellulari in carenza di calcio extracellulare, indicando che questi geni, pur appartenenti alla stessa famiglia, svolgono funzioni molto diverse. Per caratterizzare in modo efficace i flussi di calcio dovuti allo shock ipotonico abbiamo calcolato la velocità iniziale di incremento della [Ca2+]i (v0) al variare della concentrazione di calcio extracellulare. Nel ceppo selvatico i dati in nostro possesso non potevano essere interpolati da nessuna equazione di Hill, a causa di una componente additiva presente a concentrazioni submicromolari di calcio extracellulare, mentre prendendo in considerazione i dati rilevati a concentrazioni di calcio superiori a1µM possiamo osservare una perfetta Michaelis-Menten caratterizzata da una KM di 1 µM. A concentrazioni di calcio superiori a 1 µM invece la v0 subisce una forte inibizione dovuta al calcio stesso,con una IC50 di 20 µM. Al contrario i dati delle v0 calcolati nel ceppo flc2∆ sono interpolati da una curva di Hill anche a concentrazioni submicromolari di calcio,in quanto non si rileva alcuna componente additiva (dovuta probabilmente al rilascio di calcio dall’ER controllato da Flc2) a basse concentrazioni di calcio, né d’altra parte si osserva l’inibizione ad alte concentrazioni. Anche in questo caso la k è di circa 1 µM e la curva mostra un numero di cooperatività di 3. Questi dati ci portano ad affermare che il flusso di calcio a seguito di uno shock ipotonico è caratterizzato dall’attività di due diversi complessi: uno localizzato sull’ER, attivo solo quando non è disponibile calcio extracellulare e regolato da Flc2, che ha probabilmente funzione di trasporto o di attivazione del complesso; l’altro sulla membrana plasmatica, attivo solo quando è presente calcio nell’ambiente extracellulare a concentrazioni micromolari. La peculiarità di quest’ultimo complesso è che, alla luce della scomparsa dell’inibizione ad alte concentrazioni di calcio osservata nel ceppo flc2∆, anch’esso sembra coinvolgere l’attività della proteina Flc2, che è probabilmente la sub unità regolatoria sensibile al calcio del trasportatore in questione.