From intracellular antioxidant availability to modulation of nRNA metabolism: two different approaches to develop industrially attractive Saccharomyces cerevisiae strains with improved acetic acid tolerance

The challenge of biorefineries is to develop processes aimed at the complete conversion of different type of biomass feedstock (wastes are preferred) to biofuels and chemicals mainly through microbial metabolism. Unfortunately, during industrial fermentations selected microorganisms, the so-called cell factories, meet multiple stresses, associated with either the operative conditions of the process or the presence of inhibitory compounds. This causes cell metabolism and growth impairment, leading to the reduction of yield and productivity of the process. In this context, the development of improved cell factories is an important issue for the attainment of the commercial requirement for yield, productivity and titer. Several rational tools, principally based on the over-expression or deletion of single gene(s), have been applied to improve microorganisms’ robustness and so to minimize the consequences of the stressful conditions imposed by industrial fermentations. However, stress tolerant phenotypes are polygenic traits that require the simultaneous modification of multiple genes. In the last years, whole genome wide engineering approaches have been proposed to obtain complex phenotypes, including stress tolerance. The principle of these techniques is the creation of variability within a population and the subsequent selection of the desired phenotype through a suitable screening method. The yeast Saccharomyces cerevisiae is widely employed as a cell factory for the production of several industrial products, and in particular for first and second generation ethanol, due to its high ethanol yield and productivity and general robustness. However, one of the major obstacles for the development of large-scale ethanol production in second generation processes is the toxic effect of compounds released during the pre-treatment of lignocellulosic biomasses, which are used as feedstock, on cell growth and metabolism. In the present work, two different approaches to improved S. cerevisiae tolerance against acetic acid, one of the most toxic compounds deriving from biomass pre-treatment, are described. The response to acetic acid exposure in a S. cerevisiae strain engineered to endogenously produce L-ascorbic acid (L-AA) and the parental strain was evaluated and compared. The obtained results showed that the intracellular production of L-AA increases acetic acid tolerance by partially protecting cells from the acetic acid-induced programmed cell death (AA-PCD) through the reduction of ROS accumulation. Moreover, the activation of some of the most important mechanisms that participate in cell protection from acetic acid-induced stress was found to be minor in the L-AA producing compared to parental cells, suggesting that the produced antioxidant can support a more efficient stress response by both acting as a ROS scavenger and by determining an indirect energy saving caused by the minor activation of the endogenous defenses. In addition, the effect of the intracellular L-AA production on S. cerevisiae chronological lifespan (CLS) was investigated. The L-AA producing strain exhibits an extended CLS and a lower apoptosis incidence compared with the parental strain. Further investigations revealed that the extended CLS of the L-AA producing strain may result from the synergic effect of a higher resistance to acetic acid, which accumulates in the culture medium as a by-product of fermentative metabolism, together with enhanced acetate consumption. An improved resistance to acetic acid was also reached through the modulation of the mRNA metabolism. This approach was applied with the aim to unlock a complex phenotype through the modification of global gene expression at the post-transcriptional control level. To this purpose, the gene encoding for the poly(A) binding protein Pab1, that participates in the control of mRNA metabolism by interacting with several proteins, was subjected to error-prone PCR to create a mutant library that was screened in the presence of acetic acid. The screening allowed the selection of a mutant Pab1 version that increases yeast resistance to acetic acid. Furthermore, it has been demonstrated that the expression of PAB1 in a centromeric plasmid, in addition to the chromosomal copy, increases yeast growth performance under different stressful conditions, including acetic acid, and correlates with the formation of larger stress granules. Although further investigations will be needed to better understand the physiologic mechanisms responsible for the phenotype improvement, the ethanol production/productivity of the strains in which either Pab1 abundance or function have been modified will be tested in bioreactor. Overall, the obtained results suggest that the engineering of both the intracellular antioxidant availability and the mRNA metabolism can represent efficient strategies to improve the robustness of a cell factory.

Il concetto di bioraffineria prevede che quasi tutti i tipi di biomassa (preferibilmente costituiti da scarti di lavorazione e produzione) possano essere utilizzati come materia prima e convertiti in differenti tipi di biofuels e biochemicals attraverso il metabolismo microbico. Sfortunatamente, durante le fermentazioni industriali i microorganismi selezionati, definiti cell factory, incontrano diverse condizioni stressanti associate sia alle condizioni operative del processo, sia alla presenza di composti inibitori, che possono compromettere il metabolismo e la crescita cellulare e determinare la conseguente riduzione della resa e della produttività del processo stesso. In questo contesto, risulta cruciale lo sviluppo di cell factory con caratteristiche migliorate per il raggiungimento delle esigenze commerciali riguardanti la resa e la produttività. A tal proposito, diversi approcci principalmente basati sulla over-espressione o delezione di singoli geni sono stati applicati per incrementare la robustezza dei microrganismi, e quindi minimizzare gli effetti dannosi dovuti alle condizioni stressanti imposte dalle fermentazioni industriali. Tuttavia, la risposta allo stress è un tratto poligenico e l’ottenimento di fenotipi più tolleranti richiede quindi la simultanea modifica di più geni o elementi molecolari. Negli ultimi anni sono stati proposti alcuni approcci di ingegneria su scala genomica per ottenere fenotipi complessi, quali la resistenza a diversi tipi di stress. Tali metodi sono essenzialmente basati sulla creazione di varianti all’interno di una popolazione e la successiva selezione del fenotipo di interesse attraverso un idoneo metodo di screening. Il lievito Saccharomyces cerevisiae è ampiamente utilizzato come cell factory per la produzione di diversi prodotti di interesse industriale, e in particolare per la produzione di etanolo di prima e seconda generazione grazie alla elevata resa, produttività e robustezza al prodotto finale. Tuttavia, l’effetto tossico esercitato sul metabolismo e sulla crescita cellulare da parte di diversi composti, tra cui quelli liberati durante il pretrattamento delle biomasse lignocellulosiche, rappresenta uno dei maggiori ostacoli per lo sviluppo della produzione di etanolo in larga scala in processi di seconda generazione. In questo lavoro sono descritti due diversi approcci per ottenere ceppi di S. cerevisiae più tolleranti nei confronti dell’acido acetico, il quale rappresenta uno dei composti maggiormente tossici derivanti dal pretrattamento delle biomasse lignocellulosiche. La risposta cellulare nei confronti dell’acido acetico è stata determinata e comparata tra un ceppo di lievito ingegnerizzato per produrre acido L-ascorbico e il ceppo parentale. I risultati ottenuti hanno mostrato che la produzione intracellulare di acido L-ascorbico determina un’aumentata tolleranza all’acido acetico mediante la parziale protezione nei confronti del programma di morte cellulare indotto da acido acetico e la riduzione dell’accumulo di ROS. E’ stato inoltre osservato che l’attivazione di alcuni dei più importanti meccanismi coinvolti nella protezione cellulare nei confronti dello stress indotto da acido acetico è minore nel ceppo produttore di acido L-ascorbico rispetto al ceppo parentale. Nel complesso, i risultati ottenuti suggeriscono quindi che la produzione intracellulare di acido L-ascorbico possa permettere una più efficiente risposta allo stress ossidativo indotto da acido acetico sia in qualità di ROS scavenger sia mediante l’indiretto risparmio energetico causato dalla minore attivazione delle difese endogene. Dal momento che è noto in letteratura come alti livelli di ROS siano correlati con l’invecchiamento cellulare, è stata misurata la chronological life span (CLS) sia del ceppo parentale che del produttore di acido L-ascorbico, il quale ha mostrato una CLS maggiore in concomitanza con una minor percentuale di cellule apoptotiche. Ulteriori analisi hanno inoltre messo in luce che il ceppo produttore di acido L-ascorbico è più resistente all’acido acetico, il quale accumula nel terreno di coltura come sotto prodotto del metabolismo fermentativo, anche durante gli esperimenti di invecchiamento e che inoltre tende a consumarlo più rapidamente del ceppo parentale. Quindi, l’estesa CLS mostrata potrebbe essere il risultato dell’effetto cumulativo, o sinergico, di una maggiore resistenza e di un maggior consumo. In parallelo, sono stati ottenuti ceppi di S. cerevisiae con una migliorata tolleranza nei confronti dell’acido acetico mediante un approccio differente, ma comunque dall’effetto pleiotropico, che prevede la modulazione del metabolismo degli mRNA. Questo approccio è stato applicato con l’obiettivo di ottenere un fenotipo complesso attraverso l’alterazione dell’espressione genica a livello del controllo post-trascrizionale. A questo proposito, il gene codificante per la principale proteina che lega il poli(A), Pab1, la quale partecipa nel controllo del metabolismo degli mRNA interagendo con diverse proteine, è stato mutagenizzato mediante error-prone PCR. La risultante library mutata è stata successivamente sottoposta a screening in presenza di acido acetico permettendo l’identificazione di una versione mutata di Pab1 la cui espressione è in grado di determinare una maggiore tolleranza all’acido acetico. Inoltre, è stato dimostrato che l’espressione di PAB1 in un plasmide centromerico, in aggiunta alla copia cromosomica, comporta una migliore crescita in presenza di differenti condizioni stressanti, incluso lo stress indotto da acido acetico. Questo fenotipo migliorato è stato mostrato essere correlato con la formazione di più grandi e persistenti stress granule. Nonostante sarà necessario comprendere più a fondo i meccanismi fisiologici responsabili del fenotipo osservato, la produzione/produttività di etanolo da parte dei ceppi ottenuti mediante l’alterazione sia della quantità che della funzione di Pab1 sarà testata in bioreattore. Complessivamente, i risultati ottenuti suggeriscono che l’ingegnerizzazione sia della disponibilità intracellulare di un antiossidante che del metabolismo degli mRNA rappresentano delle efficaci strategie per migliorare la robustezza di una cell factory.