RIASSUNTO E SCOPO DEL LAVORO Esiste una stretta correlazione tra obesità e osteoporosi: nell'obesità si riscontra una maggiore fragilità ossea ed un ridotto assorbimento di calcio a livello intestinale, mentre l'osteoporosi è spesso accompagnata da un aumento dell'adipogenesi midollare. In questi ultimi anni un'area della ricerca scientifica si è concentrata sullo studio di nuovi farmaci/sostanze in grado di agire sull'adipogenesi o sull'osteoblastogenesi in quanto è fondamentale trovare nuove terapie che prevengano tali patologie. Conoscendo la stretta relazione tra il differenziamento adipogenico e osteogenico, un farmaco contro l'obesità non dovrebbe avere effetti sul metabolismo osseo, mentre contro l'osteoporosi non dovrebbe avere effetti sull'adipogenesi. A tale proposito gli studi in vitro rappresentano un punto importante sia per valutare l’effetto di tali sostanze che per comprendere i meccanismi alla base delle loro azioni. La maggior parte degli studi condotti sul differenziamento adipocitico, e sulla sua inibizione, sono stati condotti su linee di preadipociti murini (3T3-L1) o umani, mentre sono state utilizzate linee murine MC3T3-E1 e C3H10T1/2 per il differenziamento osteogenico. Nonostante la rilevanza dei dati ottenuti grazie a questi modelli cellulari, i risultati sono spesso controversi, anche in considerazione del fatto che i processi differenziativi nell’uomo e nei roditori possono essere regolati a livello molecolare in modo significativamente diverso. Inoltre questi modelli sono basati su cellule già indirizzate verso il differenziamento adipocitico o osteogenico, e quindi non prendono in considerazione il processo di determinazione che porta la cellula progenitrice ed indifferenziata verso un lineage mesengenico. Le cellule staminali mesenchimali (MSC) in questo contesto rappresentano un modello cellulare particolarmente utile in quanto possono essere efficacemente indotte da uno stato indifferenziato allo stato di adipociti o osteoblasti, di cui peraltro rappresentano fisiologicamente i precursori biologici. Lo scopo di questa tesi è stato quello di valutare l'effetto di Acido Valproico (AVP), Valpromide (VPM), Berberina (BRB), Hibiscus Sabdariffa (HIB) e Resveratrolo (RESV) sul differenziamento adipogenico e osteogenico di cellule staminali mesenchimali umane (hMSC). Le hMSC utilizzate in questo studio sono state caratterizzate e corrispondono ai criteri minimi stabiliti dalla letteratura (Dominici et al., 2006) per poterle definire MSC. Tre le condizioni necessarie: capacità di aderire alla plastica assumendo una morfologia simil-fibroblastica; negatività per i marker ematopoietici CD34 e CD45 e positività per i marker CD29, CD90, CD105 e CD73; capacità, sotto opportune condizioni di coltura, di differenziare nei lineage mesengenici ovvero in osteoblasti, condroblasti ed adipociti. Questo lavoro si è articolato in 5 fasi: 1) Valutazione della tossicità delle diverse sostanze. Per valutare la tossicità delle sostanze precedentemente elencate, le hMSC indifferenziate e le MSC differenziate in senso adipogenico e osteogenico sono state trattate con ciascuna delle diverse sostanze a differenti concentrazioni e sono stati effettuati saggi di vitalità. Sono stati condotti due tipi di test: MTT assay, che valuta l'attività mitocondriale come indicatore della vitalità cellulare e SRB assay, che valuta il contenuto proteico per stimare il numero delle cellule vitali. Sulla base dei risultati ottenuti sono state individuate le concentrazioni non tossiche dei diversi composti da utilizzare negli esperimenti successivi. 2) Effetto delle diverse sostanze sul differenziamento adipogenico e osteogenico. A partire da hMSC indifferenziate è possibile studiare l’intero processo adipogenico trattando le cellule con un terreno (DMEM high glucose) di induzione contenente fattori adipogenici (desametasone 1μM, indometacina/isobutilmetilxantina 100μM/500μM, insulina 10μg/ml) per i primi 10 giorni e successivamente, fino al 28° giorno, con un terreno di mantenimento (contenente insulina 10μg/ml) per la maturazione in senso adipogenico. Le diverse sostanze sono state somministrate alle hMSC sin dal momento dell'induzione e portate fino al 28° giorno di differenziamento adipogenico. L'effetto anti-adipogenico è stato valutato mediante colorazioni istologiche specifiche per i trigliceridi presenti nei depositi lipidici degli adipociti: la colorazione con Oil Red O per osservare la morfologia cellulare mentre la colorazione Nile Red, esaminata mediante citofluorimetro a flusso, per determinare il numero di cellule differenziate. I risultati dimostrano che AVP, BRB, HIB e RESV presentano un effetto anti-adipogenico, mentre VPM non ha dimostrato avere effetto sul differenziamento adipogenico. Successivamente è stato valutato l'effetto di AVP, VPM e HIB aggiunte dopo 3, 7, 10, 14 e 21 giorni dall'induzione adipogenica e analizzate tutte al 28°giorno. Con questi dati abbiamo dimostrato che solo AVP ha un effetto anti-adipogenico, anche quando viene aggiunto dopo 3 o 7 giorni dall'induzione. L'aggiunta di VPM e HIB a tempi diversi dall'induzione non ha portato a delle variazioni significative rispetto alle hMSC indotte con solo il terreno adipogenico. Per il differenziamento osteogenico le hMSC sono state trattate con uno specifico terreno (DMEM low glucose) contenente fattori osteogenici (desametasone 100nM, acido ascorbico 2-fosfato 50μM e βglicerolo 2-fosfato10mM) fino al 28° giorno. La valutazione del differenziamento osteogenico è stata effettuata mediante la colorazione istologica Alizarin red S, che evidenzia la deposizione di calcio mineralizzato. Le diverse sostanze, alle dosi precedentemente scelte, sono state aggiunte inizialmente al terreno osteogenico delle hMSC e portate fino al 28°giorno di trattamento. Da questi esperimenti abbiamo ottenuto risultati differenti per le diverse sostanze valutate. AVP e VPM determinano un precoce differenziamento osteogenico delle hMSC rispetto alle cellule trattate con solo il terreno di differenziamento. Infatti in presenza di AVP e VPM il differenziamento si osserva già dopo 10gg rispetto alle cellule trattate con solo terreno osteogenico. BRB e HIB presentano invece un effetto anti-osteogenico, poichè con l’aggiunta di queste sostanze nel terreno non si osserva deposito di matrice mineralizzata e la colorazione istologica risulta negativa. Le cellule trattate con RESV non mostrano differenze significative rispetto alle cellule trattate con solo terreno osteogenico. Successivamente per AVP, VPM e HIB è stato valutato l'effetto della sostanza aggiunta dopo 3, 7, 10, 14 e 21 giorni dall'induzione osteogenica e analizzate tutte al 28°giorno. Da questi dati abbiamo dimostrato che HIB ha un effetto anti-osteogenico anche quando aggiunta dopo 3, 7, 10 e 14 giorni dall'induzione. L'aggiunta di AVP e VPM a tempi diversi dall'induzione non ha portato variazioni significative rispetto alle hMSC indotte con solo il terreno osteogenico. 3) Valutazione dell'effetto delle sostanze sulla fosforilazione di ERK1/2 durante il differenziamento adipogenico e osteogenico. Mediante esperimenti di immunoblotting abbiamo studiato la fosforilazione (forma attiva) di ERK1/2 per poter capire i meccanismi molecolari alla base delle azioni di tali sostanze nei due diversi differenziamenti. Nelle hMSC, trattate per il differenziamento adipogenico con l'aggiunta di AVP, VPM, BRB, HIB e RESV non si sono osservate variazioni significative nella fosforilazione di ERK1/2 rispetto alle hMSC indotte con solo il terreno adipogenico. Nel differenziamento osteogenico abbiamo osservato a 10giorni una riduzione significativa della forma fosforilata di ERK1 nelle cellule trattate con VPM o BRB rispetto alle cellule trattate con solo terreno osteogenico; la forma fosforilata di ERK2 non varia. A 14giorni solo le cellule trattate con terreno osteogenico e BRB presentano una riduzione significativa di entrambe le forme pERK1/2 rispetto alle cellule trattate con solo terreno osteogenico. 4) Valutazione dell'effetto di Acido Valproico, Valpromide e Hibiscus Sabdariffa sui livelli di fosforilazione di GSK3β e di espressione di βcatenina. Per comprendere meglio il meccanismo d'azione di AVP, VPM e HIB abbiamo studiato, mediante esperimenti di immunoblotting, i livelli di fosforilazione (forma inattiva) di GSK3β e i livelli di espressione di βcatenina nelle hMSC trattate per il differenziamento adipogenico e osteogenico con l'aggiunta delle tre sostanze. Per quanto riguarda il differenziamento adipogenico solo a 3giorni di induzione abbiamo osservato nelle hMSC indotte al differenziamento con l'aggiunta di AVP un aumento significativo di pGSK3β, rispetto alle hMSC trattate con solo il terreno adipogenico. Analizzando i livelli di βcatenina a 12ore, 1, 3giorni non abbiamo rilevato variazioni significative tra le hMSC indotte al differenziamento adipogenico sia in presenza che in assenza delle sostanze. Analizzando i dati relativi al confronto tra le hMSC indotte al differenziamento osteogenico, in presenza o assenza delle sostanze, non abbiamo riscontrato differenze significative nei livelli di pGSK3β per tutti i tempi analizzati. Abbiamo osservato una riduzione significativa nei livelli di βcatenina a 3, 10 e 14giorni in hMSC trattate per il differenziamento osteogenico con l'aggiunta di AVP, mentre solo a 10giorni si osserva una riduzione significativa di βcatenina anche per le hMSC trattate con VPM rispetto alle hMSC indotte con solo terreno osteogenico. 5) Valutazione dell'effetto di Acido Valproico, Valpromide e Hibiscus Sabdariffa sull'espressione genica di C/EBPβ, PPARγ, RUNX2 e OSTERIX. Infine è stato valutato, mediante qPCR, l’effetto di AVP, VPM e HIB sull'espressione genica di C/EBPβ, PPARγ, RUNX2 e OSTERIX (importanti fattori trascrizionali adipogenici e osteogenici) durante il differenziamento adipogenico e osteogenico di hMSC. Dai risultati ottenuti si osserva che le hMSC indotte al differenziamento adipogenico con l'aggiunta di AVP hanno dei livelli di espressione significativamente maggiori per C/EBPβ e significativamente minori per PPARγ rispetto alle hMSC indotte con solo terreno adipogenico. Durante il differenziamento osteogenico si osserva un aumento significativo di Runx2 nelle hMSC trattate con AVP rispetto alle hMSC indotte con solo terreno osteogenico. L'analisi dei nostri risultati ha evidenziato che la sostanza più promettente per un eventuale uso terapeutico sembra essere l’Acido Valproico perché, oltre ad inibire il differenziamento adipogenico, sembra avere un effetto pro-osteogenico sulle hMSC indotte al differenziamento osteogenico anche se saranno necessari ulteriori studi per comprendere a pieno il meccanismo d'azione di tale sostanza.

(2013). Effetto di diverse sostanze sul differenziamento mesengenico di cellule staminali mesenchimali umane. (Tesi di dottorato, Università degli Studi di Milano-Bicocca, 2013).

Effetto di diverse sostanze sul differenziamento mesengenico di cellule staminali mesenchimali umane

CALDARA, CRISTINA
2013

Abstract

RIASSUNTO E SCOPO DEL LAVORO Esiste una stretta correlazione tra obesità e osteoporosi: nell'obesità si riscontra una maggiore fragilità ossea ed un ridotto assorbimento di calcio a livello intestinale, mentre l'osteoporosi è spesso accompagnata da un aumento dell'adipogenesi midollare. In questi ultimi anni un'area della ricerca scientifica si è concentrata sullo studio di nuovi farmaci/sostanze in grado di agire sull'adipogenesi o sull'osteoblastogenesi in quanto è fondamentale trovare nuove terapie che prevengano tali patologie. Conoscendo la stretta relazione tra il differenziamento adipogenico e osteogenico, un farmaco contro l'obesità non dovrebbe avere effetti sul metabolismo osseo, mentre contro l'osteoporosi non dovrebbe avere effetti sull'adipogenesi. A tale proposito gli studi in vitro rappresentano un punto importante sia per valutare l’effetto di tali sostanze che per comprendere i meccanismi alla base delle loro azioni. La maggior parte degli studi condotti sul differenziamento adipocitico, e sulla sua inibizione, sono stati condotti su linee di preadipociti murini (3T3-L1) o umani, mentre sono state utilizzate linee murine MC3T3-E1 e C3H10T1/2 per il differenziamento osteogenico. Nonostante la rilevanza dei dati ottenuti grazie a questi modelli cellulari, i risultati sono spesso controversi, anche in considerazione del fatto che i processi differenziativi nell’uomo e nei roditori possono essere regolati a livello molecolare in modo significativamente diverso. Inoltre questi modelli sono basati su cellule già indirizzate verso il differenziamento adipocitico o osteogenico, e quindi non prendono in considerazione il processo di determinazione che porta la cellula progenitrice ed indifferenziata verso un lineage mesengenico. Le cellule staminali mesenchimali (MSC) in questo contesto rappresentano un modello cellulare particolarmente utile in quanto possono essere efficacemente indotte da uno stato indifferenziato allo stato di adipociti o osteoblasti, di cui peraltro rappresentano fisiologicamente i precursori biologici. Lo scopo di questa tesi è stato quello di valutare l'effetto di Acido Valproico (AVP), Valpromide (VPM), Berberina (BRB), Hibiscus Sabdariffa (HIB) e Resveratrolo (RESV) sul differenziamento adipogenico e osteogenico di cellule staminali mesenchimali umane (hMSC). Le hMSC utilizzate in questo studio sono state caratterizzate e corrispondono ai criteri minimi stabiliti dalla letteratura (Dominici et al., 2006) per poterle definire MSC. Tre le condizioni necessarie: capacità di aderire alla plastica assumendo una morfologia simil-fibroblastica; negatività per i marker ematopoietici CD34 e CD45 e positività per i marker CD29, CD90, CD105 e CD73; capacità, sotto opportune condizioni di coltura, di differenziare nei lineage mesengenici ovvero in osteoblasti, condroblasti ed adipociti. Questo lavoro si è articolato in 5 fasi: 1) Valutazione della tossicità delle diverse sostanze. Per valutare la tossicità delle sostanze precedentemente elencate, le hMSC indifferenziate e le MSC differenziate in senso adipogenico e osteogenico sono state trattate con ciascuna delle diverse sostanze a differenti concentrazioni e sono stati effettuati saggi di vitalità. Sono stati condotti due tipi di test: MTT assay, che valuta l'attività mitocondriale come indicatore della vitalità cellulare e SRB assay, che valuta il contenuto proteico per stimare il numero delle cellule vitali. Sulla base dei risultati ottenuti sono state individuate le concentrazioni non tossiche dei diversi composti da utilizzare negli esperimenti successivi. 2) Effetto delle diverse sostanze sul differenziamento adipogenico e osteogenico. A partire da hMSC indifferenziate è possibile studiare l’intero processo adipogenico trattando le cellule con un terreno (DMEM high glucose) di induzione contenente fattori adipogenici (desametasone 1μM, indometacina/isobutilmetilxantina 100μM/500μM, insulina 10μg/ml) per i primi 10 giorni e successivamente, fino al 28° giorno, con un terreno di mantenimento (contenente insulina 10μg/ml) per la maturazione in senso adipogenico. Le diverse sostanze sono state somministrate alle hMSC sin dal momento dell'induzione e portate fino al 28° giorno di differenziamento adipogenico. L'effetto anti-adipogenico è stato valutato mediante colorazioni istologiche specifiche per i trigliceridi presenti nei depositi lipidici degli adipociti: la colorazione con Oil Red O per osservare la morfologia cellulare mentre la colorazione Nile Red, esaminata mediante citofluorimetro a flusso, per determinare il numero di cellule differenziate. I risultati dimostrano che AVP, BRB, HIB e RESV presentano un effetto anti-adipogenico, mentre VPM non ha dimostrato avere effetto sul differenziamento adipogenico. Successivamente è stato valutato l'effetto di AVP, VPM e HIB aggiunte dopo 3, 7, 10, 14 e 21 giorni dall'induzione adipogenica e analizzate tutte al 28°giorno. Con questi dati abbiamo dimostrato che solo AVP ha un effetto anti-adipogenico, anche quando viene aggiunto dopo 3 o 7 giorni dall'induzione. L'aggiunta di VPM e HIB a tempi diversi dall'induzione non ha portato a delle variazioni significative rispetto alle hMSC indotte con solo il terreno adipogenico. Per il differenziamento osteogenico le hMSC sono state trattate con uno specifico terreno (DMEM low glucose) contenente fattori osteogenici (desametasone 100nM, acido ascorbico 2-fosfato 50μM e βglicerolo 2-fosfato10mM) fino al 28° giorno. La valutazione del differenziamento osteogenico è stata effettuata mediante la colorazione istologica Alizarin red S, che evidenzia la deposizione di calcio mineralizzato. Le diverse sostanze, alle dosi precedentemente scelte, sono state aggiunte inizialmente al terreno osteogenico delle hMSC e portate fino al 28°giorno di trattamento. Da questi esperimenti abbiamo ottenuto risultati differenti per le diverse sostanze valutate. AVP e VPM determinano un precoce differenziamento osteogenico delle hMSC rispetto alle cellule trattate con solo il terreno di differenziamento. Infatti in presenza di AVP e VPM il differenziamento si osserva già dopo 10gg rispetto alle cellule trattate con solo terreno osteogenico. BRB e HIB presentano invece un effetto anti-osteogenico, poichè con l’aggiunta di queste sostanze nel terreno non si osserva deposito di matrice mineralizzata e la colorazione istologica risulta negativa. Le cellule trattate con RESV non mostrano differenze significative rispetto alle cellule trattate con solo terreno osteogenico. Successivamente per AVP, VPM e HIB è stato valutato l'effetto della sostanza aggiunta dopo 3, 7, 10, 14 e 21 giorni dall'induzione osteogenica e analizzate tutte al 28°giorno. Da questi dati abbiamo dimostrato che HIB ha un effetto anti-osteogenico anche quando aggiunta dopo 3, 7, 10 e 14 giorni dall'induzione. L'aggiunta di AVP e VPM a tempi diversi dall'induzione non ha portato variazioni significative rispetto alle hMSC indotte con solo il terreno osteogenico. 3) Valutazione dell'effetto delle sostanze sulla fosforilazione di ERK1/2 durante il differenziamento adipogenico e osteogenico. Mediante esperimenti di immunoblotting abbiamo studiato la fosforilazione (forma attiva) di ERK1/2 per poter capire i meccanismi molecolari alla base delle azioni di tali sostanze nei due diversi differenziamenti. Nelle hMSC, trattate per il differenziamento adipogenico con l'aggiunta di AVP, VPM, BRB, HIB e RESV non si sono osservate variazioni significative nella fosforilazione di ERK1/2 rispetto alle hMSC indotte con solo il terreno adipogenico. Nel differenziamento osteogenico abbiamo osservato a 10giorni una riduzione significativa della forma fosforilata di ERK1 nelle cellule trattate con VPM o BRB rispetto alle cellule trattate con solo terreno osteogenico; la forma fosforilata di ERK2 non varia. A 14giorni solo le cellule trattate con terreno osteogenico e BRB presentano una riduzione significativa di entrambe le forme pERK1/2 rispetto alle cellule trattate con solo terreno osteogenico. 4) Valutazione dell'effetto di Acido Valproico, Valpromide e Hibiscus Sabdariffa sui livelli di fosforilazione di GSK3β e di espressione di βcatenina. Per comprendere meglio il meccanismo d'azione di AVP, VPM e HIB abbiamo studiato, mediante esperimenti di immunoblotting, i livelli di fosforilazione (forma inattiva) di GSK3β e i livelli di espressione di βcatenina nelle hMSC trattate per il differenziamento adipogenico e osteogenico con l'aggiunta delle tre sostanze. Per quanto riguarda il differenziamento adipogenico solo a 3giorni di induzione abbiamo osservato nelle hMSC indotte al differenziamento con l'aggiunta di AVP un aumento significativo di pGSK3β, rispetto alle hMSC trattate con solo il terreno adipogenico. Analizzando i livelli di βcatenina a 12ore, 1, 3giorni non abbiamo rilevato variazioni significative tra le hMSC indotte al differenziamento adipogenico sia in presenza che in assenza delle sostanze. Analizzando i dati relativi al confronto tra le hMSC indotte al differenziamento osteogenico, in presenza o assenza delle sostanze, non abbiamo riscontrato differenze significative nei livelli di pGSK3β per tutti i tempi analizzati. Abbiamo osservato una riduzione significativa nei livelli di βcatenina a 3, 10 e 14giorni in hMSC trattate per il differenziamento osteogenico con l'aggiunta di AVP, mentre solo a 10giorni si osserva una riduzione significativa di βcatenina anche per le hMSC trattate con VPM rispetto alle hMSC indotte con solo terreno osteogenico. 5) Valutazione dell'effetto di Acido Valproico, Valpromide e Hibiscus Sabdariffa sull'espressione genica di C/EBPβ, PPARγ, RUNX2 e OSTERIX. Infine è stato valutato, mediante qPCR, l’effetto di AVP, VPM e HIB sull'espressione genica di C/EBPβ, PPARγ, RUNX2 e OSTERIX (importanti fattori trascrizionali adipogenici e osteogenici) durante il differenziamento adipogenico e osteogenico di hMSC. Dai risultati ottenuti si osserva che le hMSC indotte al differenziamento adipogenico con l'aggiunta di AVP hanno dei livelli di espressione significativamente maggiori per C/EBPβ e significativamente minori per PPARγ rispetto alle hMSC indotte con solo terreno adipogenico. Durante il differenziamento osteogenico si osserva un aumento significativo di Runx2 nelle hMSC trattate con AVP rispetto alle hMSC indotte con solo terreno osteogenico. L'analisi dei nostri risultati ha evidenziato che la sostanza più promettente per un eventuale uso terapeutico sembra essere l’Acido Valproico perché, oltre ad inibire il differenziamento adipogenico, sembra avere un effetto pro-osteogenico sulle hMSC indotte al differenziamento osteogenico anche se saranno necessari ulteriori studi per comprendere a pieno il meccanismo d'azione di tale sostanza.
MILOSO, MARIAROSARIA
Cellule staminali mesenchimali umane, differenziamento adipogenico, differenziamento osteogenico, Acido valproico, Valpromide, Berberina, Hibiscus Sabdariffa, Resveratrolo
BIO/16 - ANATOMIA UMANA
Italian
Scuola di Dottorato in Scienze Mediche Sperimentali e Cliniche
NEUROSCIENZE - 17R
26
2012/2013
(2013). Effetto di diverse sostanze sul differenziamento mesengenico di cellule staminali mesenchimali umane. (Tesi di dottorato, Università degli Studi di Milano-Bicocca, 2013).
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