Development and optimization of Reduced Representation technologies for DNA methylation and hydroxymethylation analyses

Epigenetic modifications play an important role in in the regulation of gene expression showing a huge impact on development and disease. Among these epigenetic marks, DNA methylation and hydroxymethylation are prominent actors in the epigenetic landscape. It is essential to distinguish accurately between 5mC and 5hmC to fully understand their individual contribution to gene regulation. For that, specialized techniques are needed to individually identify each mark while allowing their mapping to the genome. Among these technologies, RRBS has been developed as a reliable and cost-effective approach for 5mC studies. In this thesis we present an optimized approach of Premium RRBS kit, offered by Diagenode, to align the protocol with recent NGS advancements. Our efforts have led to a reduction in the input requirements for this technology, permitting greater experimental flexibility and versatility while still achieving a high coverage of approximately 7 million CpG sites within the human genome. Although numerous methods have been described to study DNA hydroxymethylation, there still remains a demand for a standardized procedure. To address this need, we introduce a novel nondestructive conversion protocol for the reduced representation mapping of 5hmC in the genome. Our robust and efficient technology provides a cost-effective means of analyzing both of these marks with high efficiency

Le modificazioni epigenetiche giocano un ruolo importante nella regolazione dell’espressione genica, con grande impatto sullo sviluppo e l’insorgenza di patologie. Tra queste modificazioni, la metilazione e l’idrossimetilazione del DNA sono attori di rilievo nel panorama epigenetico. È essenziale distinguere accuratamente tra ques te due modificazioni per comprenderne pienamente il contributo alla regolazione genica. Per fare ciò, sono necessarie tecniche specifiche per l’identificazione individuale di ogni fattore e per mapparlo sul genoma. Tra queste, la tecnica RRBS (Reduced repr esentation bisulfite sequencing, Sequenziamento del bisolfito a rappresentazione ridotta) è un metodo attendibile per lo studio delle 5mC (5 metilcitosine). In questa tesi, presentiamo un approccio ottimizzato del kit Premium RRBS, offerto da Diagenode per adattarne il protocollo ai recenti avanzamenti del sequenziamento di prossima generazione (Next Generation Sequencing, NGS). I nostri studi hanno portato ad una riduzione del materiale di partenza necessario per questa tecnica, permettendo maggiore flessi bilità sperimentale e versatilità, pur continuando a raggiungere un’ampia copertura nel genoma umano di circa 7 milioni di siti CpG. Nonostante numerosi metodi sono stati descritti per lo studio delle 5hmC (5 idrossimetilcitosine), permane la necessità di avere una procedura standardizzata. Per far fronte a tale esigenza, introduciamo un nuovo protocollo di conversione non distruttiva per la rappresentazione ridotta e mappatura delle 5hmC nel genoma. La nostra tecnologia, robusta ed efficace, offre un metod o economico per analizzare entrambe queste modificazioni.