Cellular and molecular characterization of the infiltrating polarized macrophages during the onset of heterotopic ossification in a mouse model of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP).

Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP) is a rare congenital disease that results in heterotopic ossification (HO) in skeletal muscles. It arises from a gain-of-function mutation (R206H) in the Acvr1 gene encoding for the activin type I receptor, which leads to the aberrant activation of the bone morphogenetic proteins and activin A signalling pathways. Patients experience episodic inflammatory flare-ups in skeletal muscles that trigger HO. The precise role of macrophages in the tissues affected by HO remains unclear and requires further elucidation. To model FOP we used the Acvr1R206Hlox/lox;Gt(ROSA26)SorCreERT2 conditional transgenic mouse strain. Computerized tomography (CT) revealed that upon expression of the mutated receptor, FOP mice develop ectopic bone after receiving muscle injury at 14 and 21 days. In order to explore the involvement of the innate immune system in the initiation and progression of HO, we selectively depleted circulating monocytes via four intravenous injections of clodronate liposomes in FOP mice. CT scans revealed significantly reduced ectopic bone formation in macrophage-depleted FOP mice compared to controls at 14 and 21 days post-injury. To gain further insights into the early signalling leading to HO, single-cell RNA sequencing was performed on muscles of FOP mice 5 and 7 days after pinch injury. Bioinformatic analysis revealed that fibro-adipogenic progenitors (FAPs) were enriched in pathways related to chondro/osteogenesis and hypoxia in FOP mice. Furthermore, FOP macrophages exhibited heightened expression of osteoclast differentiation markers and displayed an upregulated pro-inflammatory profile. In summary, these findings affirm that FOP mice faithfully replicate the features observed in patients and underscore the critical role of macrophages in HO. Importantly, single-cell transcriptomics suggests that macrophages and FAPs collaborate to form a cellular environment that promotes and sustains bone formation, even in the early stages of FOP mice.

La fibrodisplasia ossificante progressiva (FOP) è una rara malattia congenita che provoca l'ossificazione eterotopica (HO) nei muscoli scheletrici. Deriva da una mutazione con guadagno di funzione (R206H) nel gene Acvr1 che codifica per il recettore dell'activina di tipo I, che porta all'attivazione aberrante delle proteine morfogenetiche ossee e delle vie di segnalazione dell'activina A. I pazienti sperimentano riacutizzazioni infiammatorie episodiche nei muscoli scheletrici che innescano l'HO. Il ruolo preciso dei macrofagi nei tessuti affetti da HO rimane poco chiaro e richiede ulteriori chiarimenti. Per modellare FOP abbiamo utilizzato il ceppo murino transgenico condizionale Acvr1R206Hlox/lox; Gt(ROSA26)SorCreERT2. La tomografia computerizzata (TC) ha rivelato che dopo l'espressione del recettore mutato, i topi FOP sviluppano osso ectopico dopo aver ricevuto danno muscolare a 14 e 21 giorni. Al fine di esplorare il coinvolgimento del sistema immunitario innato nell'inizio e nella progressione dell'HO, abbiamo diminuito selettivamente i monociti circolanti tramite quattro iniezioni endovenose di liposomi contenenti clodronato in topi FOP. Le scansioni TC hanno rivelato una formazione ossea ectopica significativamente ridotta nei topi FOP impoveriti di macrofagi rispetto ai controlli a 14 e 21 giorni dopo il danno. Per ottenere ulteriori informazioni sulla segnalazione precoce che porta all'HO, il sequenziamento dell'RNA a singola cellula è stato eseguito sui muscoli di topi FOP a 5 e 7 giorni dopo il danno. L'analisi bioinformatica ha rivelato che i progenitori fibro-adipogenici (FAP) sono arricchiti in vie di segnalazione correlate alla condro/osteogenesi e all'ipossia nei topi FOP. Inoltre, i macrofagi FOP hanno mostrato una maggiore espressione dei marcatori di differenziazione degli osteoclasti e hanno mostrato un profilo pro-infiammatorio sovraregolato. In sintesi, questi risultati affermano che i topi FOP replicano fedelmente le caratteristiche osservate nei pazienti e sottolineano il ruolo critico dei macrofagi nell'HO. È importante sottolineare che la trascrittomica a singola cellula suggerisce che i macrofagi e i FAP collaborano per formare un ambiente cellulare che promuove e sostiene la formazione ossea, anche nelle prime fasi dei topi FOP.