Genome editing strategy to treat Severe Combined Immunodeficiency due to Recombination Activating Gene 1 (RAG1) defects

Recombination Activating Genes (RAG) are tightly regulated during lymphoid differentiation and their mutations cause a spectrum of severe immunological disorders. Hematopoietic stem/progenitor cell (HSPC) transplantation is the treatment of choice but limited by donor availability and toxicity. To overcome these issues, we developed gene editing (GE) strategies targeting a corrective sequence into the human RAG1 gene by homology-directed repair (HDR) and validated them by tailored 2D, 3D and in vivo platforms to stringently assess rescue of expression and function. Whereas integration into intron 1 achieved suboptimal levels of correction, in-frame insertion into exon 2 drove faithful recapitulation of physiologic hRAG1 expression and activity, allowing to concomitantly disrupt dominant-negative effects of unrepaired hypomorphic alleles. Enhanced HDR-mediated GE enabled highly efficient hRAG1 reconstitution in HSPCs from healthy donors and hypomorphic RAG1 patients, supporting T-cell differentiation and overcoming the patients’ B-cell differentiation block. Gene correction efficiency exceeded the minimal proportion of functional HSPCs required to rescue immunodeficiency in Rag1-/- mice, strongly supporting the clinical translation of HSPC GE for treating RAG1 deficiency.

I Geni Attivatori di Ricombinazione (RAG) sono strettamente regolati durante la differenziazione linfocitaria e le loro mutazioni causano una serie di gravi disturbi immunologici. Il trapianto di cellule staminali/progenitrici ematopoietiche (HSPC) è il trattamento di elezione, ma è limitato dalla disponibilità dei donatori e dalla tossicità. Per superare questi problemi, abbiamo sviluppato strategie di modifica genetica mirate all'inserimento di una sequenza correttiva nel gene RAG1 umano mediante riparazione diretta dell'omologia (HDR) e le abbiamo convalidate attraverso piattaforme su misura in 2D, 3D e in vivo per valutare rigorosamente il ripristino dell'espressione e della funzione. Mentre l'integrazione nell'introne 1 ha raggiunto livelli di correzione subottimali, l'inserimento in fase nell'esone 2 ha consentito una fedele riproduzione dell'espressione e dell'attività fisiologica di RAG1, permettendo contemporaneamente di interrompere gli effetti dominanti-negativi degli alleli ipomorfici non riparati. La nostra strategia di editing mediante HDR ha reso altamente efficiente la ricostituzione di RAG1 nelle HSPC da donatori sani e pazienti con mutazioni ipomorfiche di RAG1, sostenendo la differenziazione delle cellule T e superando il blocco della differenziazione delle cellule B nei pazienti. L'efficienza di correzione genetica ha superato la proporzione minima di HSPC funzionali richiesta per salvare l'immunodeficienza nei topi Rag1-/-, supportando fortemente la traduzione clinica della strategia di editing delle HSPC per il trattamento della deficienza causata da mutazioni di RAG1.