Infant ALL with MLL-AF4 is sustained by t(4;11) as the sole genetic abnormality, and it is initiated in mice by phenotypically and functionally distinct leukemic stem cell subsets

Ogni giorno, circa mille miliardi di nuove cellule vengono prodotte dal midollo osseo e messe in circolazione nel sangue periferico per far fronte alle necessità del nostro organismo. Tutte le cellule che compongono il nostro sangue, derivano da una stessa cellula-madre, chiamata cellula staminale ematopoietica, un precursore primordiale e immaturo che ha la capacità di espandersi e la potenzilità di differenzare a eritrociti, linfociti, leucociti, piastrine. Il processo di differenziamento che va dalla cellula staminale alle cellule mature circolanti è detto emopoiesi. La leucemia è un tipo di tumore circolante che può avere origine da una cellula qualunque del sangue, a un qualsiasi stadio differenziativo, la quale inizia a proliferare all’impazzata, sfuggendo ad ogni controllo, e prende il sopravvento sulle altre cellule sane. Il risultato è l’espansione aberrante di un singolo tipo cellulare, a discapito degli altri compartimenti, che causa una disfunzione del sistema emopoietico. La leucemia non può essere considerata un’ unica malattia, poichè ne esistono molti diversi tipi, a seconda del tipo cellulare interessato, e del tipo di mutazione genica che la caratteizza. Nel nostro laboratorio, presso il Centro di Ricerca M. Tettamanti dell’Opedale S. Gerardo di Monza, ci occupiamo delle leucemie del bambino. In particolare, nel mio periodo di dottorato, mi sono occupata di studiare una particolare forma di leucemia linfoblastica acuta, detta infant LLA, ad insorgenza nel primo anno di vita, che presenta il riarrangiamento del gene MLL. Questa leucemia rappresenta la forma prevalente in età neonatale, ed è purtoppo una malattia molto aggressiva con prognosi infausta che in Italia colpisce circa 10-12 nuovi nati all’anno. In particolare, i casi che presentano la traslocazione t(4;11) con espressione del prodotto di fusione MLL-AF4 rappresentano il sottogruppo genetico a incidenza maggiore in età neonatale. Per moltissimi aspetti, sia dal punto di vista clinico che biologico, la LLA infant rappresenta una malattia peculiare, diversa dalle altre forme di leucemia dell’età pediatrica e adulta. In questi quattro anni di dottorato mi sono occupata nello specifico di due progetti. Nel primo, in collaborazione con il Prof. Jacobsen in Svezia, ci siamo proposti di identificare, isolare e caratterizzare dal punto di vista biologico e funzionale la ‘cellula staminale leucemica’ della LLA infant con riarrangiamento del gene MLL. Nel secondo studio, pubblicato su ‘Leukemia’ abbiamo voluto valutare se il solo riarrangiamento del gene MLL fosse di per se sufficiente per dare origine alla malattia, oppure se alterazioni genetiche ulteriori, secondarie al riarrangiamento di MLL che costituisce il primo evento, fossero necessarie per la manifestazione clinica della leucemia. La composizione cellulare di ogni singolo tumore umano è altamente eterogenea, e non tutte le cellule che lo compongono sono capaci di sostenerne la crescita. Per spiegare queste osservazioni è stata postulata l’esistenza di un sottogruppo ristretto di cellule, dette staminali tumorali (CSC), o staminali leucemiche (LSC) nel caso si tratti di leucemia, che hanno la potenzialità di auto-rigenerarsi e di riprodurre l’intera massa tumorale. Secondo il modello della ‘cellula staminale tumorale’, in tutti i tumori solo un ristretto gruppo di cellule è capace di generare l’intera massa tumorale e sostenerne la crescita all’infinito. Poter bersagliare in modo specifico questa cellula significa eradicare definitivamente la malattia, che altrimenti inevitabilmente si rigenererebbe. Questa ipotesi è in contrasto con il precedente modello stocastico secondo cui ogni cellula che compone il tumore è potenzialmente capace di sostenerne la crescita: tuttavia la eterogenicità tumorale, e la sua bassa tumorigenicità sono dovute alla scarsa probalilità per una cellula di iniziare il ciclo cellulare e proliferare. Tuttavia recenti studi mettono in discussione l’ipotesi stessa dell’esistenza di una CSC, ed attualmente l’opinione scientifica è divisa riguardo al fatto se il modello gerarchico della CSC, piuttosto che il classico modello stocastico, siano più adatti per spiagere il meccanismo biologico alla base dell’insorgenza dei tumori umani. Infatti, benchè il concetto di CSC sia intuitivamente immediato, la sua effettiva identificazione e caratterizzazione si è rivelata inaspettatamente complicata, e ad oggi, non esiste una definizione universale di CSC. Il termine ‘leucemia’ comprende in realtà tantissimi tipi differenti di tumore, e tale eterogeneità si riflette sulla LSC. La specifica alterazione genetica, la cellula di origine (cioè la cellula inizialmente colpita dal primo evento trasformante da cui il tumore ha avuto luogo), le diverse metodologie in vivo applicate, l’influenza del microambiente midollare e l’alta variabilità fenotipica tra diversi pazienti affetti dalla medesima forma di leucemia, hanno portato inevitabilmente alla generazione di risultati apparentementente contrastanti tra i vari gruppi di ricerca che indipendentemente si sono riproposti di identificare la LSC. Il modello sperimentale d’elezione per identificare la LSC è il trapianto in vivo di blasti leucemici in topi umanizzati immunocompromessi, capaci di accettare cellule umane senza rigettarle e permetterne l’attecchimento. Nel periodo all’estero trascorso nel laboratorio del Porf. Jacobsen a Lund, mi sono occupata di mettere a punto il modello di trapianto in vivo di cellule leucemiche da pazienti affetti da infant LLA in topi unamizzati. Previa irradiazione subletale del topo ricevente, che ha il duplice scopo di eliminare le cellule circolanti murine mature e creare spazio per le cellule umane trapiantate, i blasti leucemici vengono iniettati nel topo per via sistemica attraverso la vena della coda.. Se l’attecchimento è avvenuto, già dopo poche settimane, i topi mostreranno alti livelli di ricostituzione nel midollo e nei compartimenti extramidollari (come milza, fegato e sangue periferico), con conseguente manifestazione dei sintomi clinici della malattia (quali splenomegalia, pelo arruffato, letargia, anoressia, perdita di peso e decesso). L’attecchimento viene valutato eseguendo periodiche biopsie midollari (dopo 6, 9, 12 o più settimane dal trapianto) dalla sede femorale, in anestesia generale, e successivamente la presenza di cellule leucemiche umane è rilevata nell’aspirato midollare tramite analisi successive. Nel primo lavoro inviato a ‘Cancer Cell’ abbiamo osservato che nella LLA infant MLL-AF4 positiva la LSC risiede nella frazione CD19+, costituita da linfociti B a diversi stadi maturativi. Infatti, la frazione CD19- è composta sia da cellule staminali normali residue (non leucemiche) che danno luogo a una ricostituzione normale in vivo, che da cellule leucemiche (MLL riarrangiate), tuttavia prive di potenziale leucemogenico, poiché incapaci di ripopolare il midollo di un topo irradiato e dare origine alla leucemia. Inoltre abbiamo dimostrato che all’interno della frazione CD19+, esistono molteplici sottopolazioni LSC con diverso potenziale leucemogenico e diverse caratteristiche biologiche e funzionali in vivo (es. penetranza, latenza di insorgenza della malattia e fenotipo della leucemia risultante). In conclusione, i nostri risultati dimostrano che, a differenza del modello convenzionale, esistono molteplici sottopopolazioni LSC con caratteristiche biologiche e funzionali distinte, che possono essere distinte tra loro e dalla restante popolazione leucemica (non tumorigenica) sulla base dell’espressione di determinati antigeni di superficie. Nel secondo studio pubblicato su ‘Leukemia’, ci siamo chiesti se la sola presenza della traslocazione del gene MLL fosse di per se sufficiente per la manifestazione clinica della malattia, o se mutazioni accessorie cooperanti fossero necessarie. Per fare ciò abbiamo analizzato a livello genomico un gruppo consistente di pazienti affetti da LLA infant MLL-AF4 positiva, tramite tecniche sofisticate di screening su tutto il genoma ad alta risoluzione, e abbiamo osservato che, contrariamente ai pazienti affetti da altri tipi di LLA pediatrica ad insorgenza dopo l’anno, nella LLA infant MLL-AF4 positiva non si rilevano mutazioni aggiuntive. Questi risultati dimostrano che il solo riarrangiamento di MLL è necessario e sufficiente per la manifestazione, in tempi brevi, della malattia conclamata, a differenza di altre forme di leucemia del bambino e dell’adulto, in cui mutazioni genetiche aggiuntive sono indispensabili. Inoltre tali evidenze ribadiscono ulteriormente che la LLA infant con riarangiamento di MLL è una malattia nica dal punto di vista biologco, diversa dagli altri tipi di leucemia, e che che il meccanismo di leucemogenesi può essere distinto. Considerando l’alta mortalità, l’alto rischio di ricaduta, la prognosi infausta della LLA infant MLL positiva e l’urgente necessità di avere a disposizione nuove ed efficaci terapie antitumorali, questi studi sono di rilevante importanza, in quanto non solo aiutano a comprendere meglio i meccanismi di insorgenza della LLA infant e fare luce sulla biologia e l’aggressività di questa malattia, ma rappresentano anche il punto di partenza per identificare nuove strategie terapeutiche al fine bersagliare la LSC ed eradicare la malattia in modo definitivo.