Exploiting H-ferritin nanoconjugates to improve cancer immunotherapy and drugs delivery

Cancer is a leading cause of disease worldwide and glioblastoma and triple negative breast cancer represent two types of tumors with poor prognosis and a high risk of recurrence. The therapeutic options currently in use are still subject to failure, due to (1) the poor selectivity of drugs, which compromises dose escalation to more therapeutically active levels and (2) the development of resistance by different mechanisms that cells put in place to defend themselves from the action of drugs. In this scenario, nanoparticles can be developed as new therapeutic strategies or to overcome the limitations of the treatments currently in use. In my PhD project, I exploited the unique features of a nanoparticle-based on recombinant heavy-chain ferritin cages (HFn) to improve the therapeutic treatments already available for these tumors. HFn can be a promising candidate for this study because 1) it is biocompatible; 2) it can be loaded with drugs; 3) it can be easily modified by exploiting the functional groups on its surface; 4) it exhibits tumor targeting by recognition of TfR1, overexpressed in 98% of human cancers and directly correlated with tumor stage or cancer progression; 5) HFn is able to cross the blood-brain barrier (BBB) exploiting the same TfR1 receptor, also found overexpressed on the BBB endothelial wall. My work is divided into two main subprojects, all sharing the use of HFn. In the first subproject (chapter one), the functional groups present on the surface of HFn were exploited for the conjugation of the monoclonal antibody cetuximab, studying the maintenance of its anticancer activity against a 3D tumor model in comparison with unconjugated cetuximab. Cancer spheroids of glioblastoma and triple negative breast cancer were selected and produced for this study. Then we focused on the documented ability of cetuximab to promote an indirect anticancer effect (ADCC) through the activation of immune systems cells. ADCC activation was evaluated both in live imaging and with an end-point assay monitoring the caspase production as a direct measure of cellular apoptosis. The co-incubation of cancer spheroids, HFn-mAb nanoconjugate and immune system cells showed that not only conjugated cetuximab maintained its anticancer effect but caused a higher apoptotic effect in comparison with cetuximab alone. Moreover, a preliminary biodistribution in vivo experiment showed a specific tumor accumulation of the nanoconjugate. In the second subproject (chapter two), HFn nanocages were exploited for the encapsulation of a chemotherapeutic drug, cisplatin (CISP). We compared a pH-based and a temperature-based encapsulation strategy and, even though the encapsulation efficiency and HFn recovery seemed higher with the second protocol, the protein stability was compromised. This result led to the choice to use pH-encapsulated cisplatin to perform future in vitro cytotoxicity studies on 2D and 3D models of triple negative breast cancer. In this project, ferritin’s external surface and inner cavity were exploited to create nanoconjugates with potential anticancer effects. In the future, we also plan to co-administer HFn-mAb and cisplatin-loaded HFn in order to combine the immune system activation with the chemotherapeutic activity of this drug.

Il cancro è una delle principali cause di morte nel mondo e glioblastoma e tumore al seno triplo negativo sono due tipologie di tumore caratterizzate da una prognosi sfavorevole e da un alto rischio di recidive. I trattamenti farmacologici oggi a disposizione non sono sufficienti all’ottenimento di una guarigione completa sia a causa della bassa selettività che impedisce l’utilizzo di dosaggi più elevati, sia a causa dello sviluppo di meccanismi di resistenza da parte delle cellule tumorali. In questo contesto le nanoparticelle possono essere sviluppate sia come nuovi trattamenti terapeutici sia per superare alcune limitazioni delle terapie convenzionali. In questo progetto di tesi, ho scelto di utilizzare nanoparticelle di H-ferritina (HFn), una forma ricombinante di ferritina che possiede alcune caratteristiche che la rendono un buon candidato per migliorare i trattamenti terapeutici già disponibili per questi due tumori. L’HFn è infatti biocompatibile, la sua cavità interna può essere utilizzata per il caricamento di farmaci e molecole di detection e la sua superficie può essere facilmente modificata sfruttando i numerosi gruppi funzionali esposti verso l’esterno. La HFn è, inoltre, in grado di legarsi al recettore della transferrina (TfR1), over-espresso dal 98% dei tumori solidi. Tale recettore è over espresso anche dalle cellule endoteliali che compongono la barriera ematoencefalica, rendendo così la HFn in grado di attraversarla. Il mio lavoro di tesi può essere suddiviso in due progetti. Nel primo progetto i gruppi funzionali esposti sulla superficie della HFn sono stati utilizzati per la coniugazione dell’anticorpo monoclonale cetuximab al fine di studiare il mantenimento della sua attività antitumorale in modelli tumorali 3D e di paragonarla a quella del cetuximab non coniugato. Come modelli tumorali 3D sono stati utilizzati sferoidi ottenuti da una linea cellulare di glioblastoma e da una di tumore al seno triplo negativo. Sulla base dei promettenti risultati ottenuti sui modelli 2D, è stata valutata la capacità del CTX coniugato all’HFn di promuovere un’azione antitumorale indiretta (ADCC) grazie all’attivazione del sistema immunitario. L’attivazione dell’ADCC è stata valutata sia in live imaging che con un saggio ad end-point quantificando la produzione di caspasi come indicazione diretta dell’apoptosi delle cellule tumorali. Gli esperimenti finora condotti hanno evidenziato che il CTX coniugato all’HFn non solo ha mantenuto il suo effetto apoptotico sulle cellule tumorali ma tale effetto si è rivelato anche maggiore rispetto a quello dell’anticorpo da solo. Infine, un esperimento preliminare in vivo ha evidenziato un accumulo preferenziale del nanoconiugato al tumore. Nel secondo progetto la cavità della HFn è stata utilizzata per l’incapsulamento del farmaco chemioterapico cisplatino. Per l’incapsulamento sono state utilizzate due diverse strategie, una basata sulla capacità della HFn di disassemblarsi e riassemblarsi a seguito di variazioni di pH e la seconda basata sulla presenza di un canale endogeno sensibile alle fluttuazioni di temperatura. Anche se l’efficienza di incapsulamento e il recovery della HFn sono risultate maggiori con il secondo metodo, tale reazione ha comportato la formazione di aggregati, compromettendo la stabilità della proteina. Per questo motivo l’incapsulamento basato sul pH è stato scelto per produrre nanoconiugati che verranno in futuro testati su modelli 2D e 3D di tumore al seno triplo negativo. In questo progetto la superficie esterna della HFn e la sua cavità interna sono state sfruttate per creare nanoconiugati con un potenziale effetto antitumorale. In futuro queste due formulazioni potranno anche essere co-somministrate per combinare l’attivazione del sistema immunitario all’effetto chemioterapico del cisplatino incapsulato.