Unleashing the hidden power of Saccharomyces cerevisiae for industrial relevant molecules

The construction of microbial cell factories for the biosynthesis of molecules of interest is one of the essential prerogatives to face an exponential population increase. Taking full advantage of metabolism remains a challenge that has become extremely popular among researchers. Exploiting metabolic pathways using a rewarding approach is often only feasible through metabolic engineering techniques, which enable distinctive utilization of the route to produce compounds of interest. Among all, Saccharomyces cerevisiae is one of the best cell factories currently used in numerous industrial processes, such as the production of biofuels. The main body of this thesis focuses on extending the range of applications to produce molecules of strong industrial interest by exploiting the innate and hidden capabilities of S. cerevisiae. In the first part of this work, we explored the potential to produce ammonia. Currently, production is predominantly by chemical synthesis, and the need to move towards more sustainable society has led researchers to find microorganisms capable of producing chemicals. Intrigued by what had been done in previous studies with bacteria, we induce S. cerevisiae to take advantage of natural nitrogen substrates through an Adaptive Laboratory Evolution strategy. Results showed a marked ability to secrete ammonia revealing a pattern in the use of unconventional substrates. Using bioreactor cultivation techniques and exploiting the unknown natural metabolism of yeast, we achieved 2,03 grams of ammonia, which is the highest recorded with Saccharomyces cerevisiae to date. In the second part, the main purpose was to examine trehalose accumulation and explore its potential applicability. We isolated a specific yeast strain in which the genes responsible for the breakdown of trehalose were deleted (neutral and acid trehalose) and unexpectedly noticed an increased amount of this molecule being mobilized from the cytosol to the extracellular environment. The study of phenomena highlight dependence on its substrates, (UDP-gulch and Glc6P), high synthase activity and a single locus responsible for the trehalose secretion phenotype, which remains a novelty up to date. Full optimization in bioreactor allowed us to successfully produce trehalose in the culture broth with the absence of other sugars. A thorough demonstration of the applicability of this technology under different operational conditions has enabled the investigation of its potential applications in industrial field. Overall, the results of this thesis have confirmed that strategies of physiological rewiring applied to the correct genetic background can be useful in uncovering hidden features of yeast.

Lo sviluppo di “fabbriche cellulari” microbiche per la biosintesi di molecole di interesse è uno dei possibili approcci per affrontare l’aumento esponenziale della popolazione. Attualmente in letteratura si ritrovano innumerevoli esempi di questo approccio applicati a svariati prodotti. Trarre profitto dai percorsi metabolici noti è spesso possibile solo attraverso tecniche di ingegneria metabolica, per reindirizzare il metabolismo e forzarlo verso l’accumulo dei metaboliti di interesse. Tra tutti i microorganismi, il lievito Saccharomyces cerevisiae è una delle migliori fabbriche cellulari attualmente utilizzate in numerosi processi industriali, come ad esempio la produzione di biocarburanti. Il corpo principale di questo lavoro è incentrato sull'estensione della gamma di applicazioni per produrre molecole di forte interesse industriale sfruttando le capacità innate e non ancora esplorate di S. cerevisiae. Nella prima parte del lavoro abbiamo valutato la possibilità di produrre ammoniaca. Attualmente, la produzione avviene prevalentemente per sintesi chimica ma la necessità di ridurre l’inquinamento e trovare vie sintetiche rinnovabili ha condotto i ricercatori a testare le produzioni per via microbica. Ispirati dai precedenti studi con batteri, abbiamo indotto S. cerevisiae a sfruttare sostanze azotate naturali attraverso una strategia di evoluzione adattiva. I risultati hanno mostrato una marcata capacità di secernere ammoniaca utilizzando nutrienti non convenzionali. Mediante tecniche di coltivazione in bioreattore e sfruttando il metabolismo naturale del lievito, abbiamo raggiunto 2,03 grammi di ammoniaca totale prodotta che, ad oggi, è il più alto valore registrato con S. cerevisiae. Nella seconda parte di questo lavoro, lo scopo principale è stato quello di esaminare l'accumulo di un altro metabolita chiamato trealosio, esplorando le sue potenziali applicazioni. Abbiamo isolato un ceppo di lievito specifico in cui i geni responsabili della degradazione del trealosio sono stati eliminati (trealasi neutra e acida) e abbiamo osservato in maniera inaspettata una quantità maggiore di questa molecola che viene mobilizzata dal citosol all'ambiente extracellulare. Lo studio del fenomeno evidenzia la dipendenza dai suoi substrati (UDP-Glc e Glc6P), un'alta attività di sintesi e un singolo locus genico responsabile del fenotipo di secrezione di trealosio, che rappresenta una novità di sicuro interesse applicativo. L'ottimizzazione del processo in bioreattore ci ha permesso di raggiungere con successo concentrazioni elevati di trealosio nel brodo di coltura con l'assenza di altri zuccheri. La dimostrazione approfondita dell'applicabilità di questa tecnologia mediante diversi regimi operativi permette di rendere il processo appetibile a livello industriali. Nel complesso, i risultati di questa tesi hanno confermato che le strategie di modulazione del lievito applicate al corretto background genetico possono essere utili per sfruttare queste cellule stimolando e utilizzando aspetti ancora ignoti del suo metabolismo.