Calcineurin is a serine-threonine phosphatase that can dephosphorylate a large number of substrates, among which there is the transcription factor NFAT. My research activity has focused on investigating the role of calcineurin (Cn) in “cold” tumors, and in particular the role of the Cn-NFAT axis. This axis is known to play various protumorigenic roles in tumors and its modulation could prove beneficial towards the development of novel therapies, since cold tumors are notoriously refractory to immunotherapy. We employed genetically engineered tumor cell lines to study the impact of a constitutive inhibition of the Cn-NFAT interaction both in vitro and in vivo. We investigated the impact that this inhibition has in vitro by confirming that there is no cytostatic effect that could confound ulterior results and no alterations in the cell cycle. We also confirmed that growth wasn’t altered in vivo. We performed an RNA sequencing on cells cultivated both in 2D and in 3d in order to determine the global expression variations that this inhibition induced in our cell line models. Based on the data analysis we identified several pathways that were altered based on the specific cultivation techniques we used. From this we could infer that the Cn-NFAT axis plays a role in several cell processes such as epithelial-to-mesenchymal transition and also oxidative phosphorylation. Since NFAT is known to contribute to the tumor microenvironment, we investigated whether there are any alterations in the immune infiltrate in vivo. Surprisingly we found that in our model there was an enhanced recruitment of CD8+ T cells. Further analysis of the RNAseq data revealed that the impairment of the Cn-NFAT axis induced an increased production of T cell chemotactic factors such as cytokines and chemokines. Indeed, the inhibition of these pathways in vivo abrogated the T cell recruitment. We then sought to understand why this increase in the CD8+ T cell infiltrate did not result in alterations in cancer growth and hypothesized that the tumors employ active strategies of immunosuppression. We therefore analyzed the exhaustion state of the infiltrating T cells and observed an increase in the “progenitor exhausted” populations, suggesting that their activation status can be modulated by immunotherapy. Indeed, the administration of an immune checkpoint blockade greatly diminished tumor growth. To corroborate these data in humans, we analyzed publicly available databases of transcriptomic data and indeed found a correlation between the expression of T cell chemotactic factors and patient survival. Overall, our data suggest that the inhibition of the Cn-NFAT axis can enhance existing immunotherapies.

La calcineurina (Cn) è una Serina/Treonina-fosfatasi responsabile della defosforilazione di una numerosa serie di substrati tra cui il fattore trascrizionale NFAT. L’asse calcineurina-NFAT è noto essere in grado di regolare molteplici processi tumorigenici quali proliferazione, sopravvivenza, transizione epitelio-mesenchimale e metastatizzazione e pertanto si presenta come ottimo bersaglio per lo studio dei meccanismi di tumorigenesi. In particolare, è stato studiato il ruolo dell’asse calcineurina-NFAT nei tumori “freddi”, in quanto refrattari alle immunoterapie moderne. Pertanto bersagliare questo asse potrebbe offrire nuove opportunità terapeutiche. Per gli studi sono state utilizzate delle linee cellulari tumorali murine geneticamente modificate per avere un blocco costitutivo dell’interazione tra calcineurina ed NFAT. L’inibizione farmacologica dell’attività enzimatica della calcineurina con farmaci quali Ciclosporina A e Tacrolimus è noto causare un effetto citostatico. È stato dunque verificato che il blocco dell’interazione calcineurina-NFAT non impattasse la crescita ed il ciclo cellulare, che avrebbe potuto introdurre un ulteriore bias nel modello. Per verificare gli effetti globali di questo blocco dell’interazione Cn-NFAT sullo stato delle cellule coltivate in 2D ed in 3D è stato effettuato un sequenziamento degli RNA in bulk. Dall’analisi dei dati sono emerse come alterate diverse vie di segnalazione cellulare, a seconda delle condizioni di coltura, ed in particolare la via della transizione epitelio-mesenchimale, le vie infiammatorie e le vie coinvolte nella fosforilazione ossidativa. Essendo noto il ruolo di NFAT nella regolazione del microambiente tumorale, sono stati anche indagati gli effetti dell’inibizione dell’asse Cn-NFAT in vivo, in modelli murini di tumori sottocutanei. Sorprendentemente, è stato osservato un aumento dell’infiltrato intratumorale di cellule T CD8+. Un’ulteriore analisi dei dati di sequenziamento dell’RNA ha evidenziato come i tumori in cui l’asse Cn-NFAT è inibito presentano una maggiore produzione di citochine e chemochine con funzione chemoattraente per le cellule T CD8+. Questo aumento è stato ulteriormente confermato anche in vitro tramite qRT-PCR. Inoltre, l’inibizione di queste citochine in vivo ha annullato l’incremento nel reclutamento delle cellule T CD8+ nei tumori in cui manca l’interazione Cn-NFAT. Il ruolo antitumorale delle cellule CD8+ è ampiamente noto. Nel nostro modello tuttavia il semplice reclutamento di queste cellule non ha determinato cambiamenti nella crescita. Per chiarire meglio questo aspetto è stato indagato lo stato di esaurimento di queste cellule. È stato pertanto osservato che i tumori in cui l’asse Cn-NFAT è inibito presentano un maggior numero di cellule T CD8+ esaurite definite “progenitor exhausted”, che possono dunque essere riattivate tramite immunoterapia. Pertanto la somministrazione di un inibitore degli immunocheckpoint è risultata in una diminuzione notevole della crescita tumorale. Per corroborare questi risultati nell’uomo sono stati analizzati dei dati pubblici di trascrittomica, che hanno evidenziato una correlazione positiva tra l’espressione di fattori chemotattici per le cellule T CD8+ e la sopravvivenza dei pazienti. Insieme questi risultati indicano che l’inibizione intratumorale dell’asse calcineurina-NFAT può rappresentare una nuova strategia terapeutica che può affiancare in maniera sinergica le attuali immunoterapie.

(2023). Role of tumor-intrinsic calcineurin in shaping the tumor microenvironment and regulating the cytotoxic T cell response. (Tesi di dottorato, Università degli Studi di Milano-Bicocca, 2023).

Role of tumor-intrinsic calcineurin in shaping the tumor microenvironment and regulating the cytotoxic T cell response

VALACHE, MIHAI
2023

Abstract

Calcineurin is a serine-threonine phosphatase that can dephosphorylate a large number of substrates, among which there is the transcription factor NFAT. My research activity has focused on investigating the role of calcineurin (Cn) in “cold” tumors, and in particular the role of the Cn-NFAT axis. This axis is known to play various protumorigenic roles in tumors and its modulation could prove beneficial towards the development of novel therapies, since cold tumors are notoriously refractory to immunotherapy. We employed genetically engineered tumor cell lines to study the impact of a constitutive inhibition of the Cn-NFAT interaction both in vitro and in vivo. We investigated the impact that this inhibition has in vitro by confirming that there is no cytostatic effect that could confound ulterior results and no alterations in the cell cycle. We also confirmed that growth wasn’t altered in vivo. We performed an RNA sequencing on cells cultivated both in 2D and in 3d in order to determine the global expression variations that this inhibition induced in our cell line models. Based on the data analysis we identified several pathways that were altered based on the specific cultivation techniques we used. From this we could infer that the Cn-NFAT axis plays a role in several cell processes such as epithelial-to-mesenchymal transition and also oxidative phosphorylation. Since NFAT is known to contribute to the tumor microenvironment, we investigated whether there are any alterations in the immune infiltrate in vivo. Surprisingly we found that in our model there was an enhanced recruitment of CD8+ T cells. Further analysis of the RNAseq data revealed that the impairment of the Cn-NFAT axis induced an increased production of T cell chemotactic factors such as cytokines and chemokines. Indeed, the inhibition of these pathways in vivo abrogated the T cell recruitment. We then sought to understand why this increase in the CD8+ T cell infiltrate did not result in alterations in cancer growth and hypothesized that the tumors employ active strategies of immunosuppression. We therefore analyzed the exhaustion state of the infiltrating T cells and observed an increase in the “progenitor exhausted” populations, suggesting that their activation status can be modulated by immunotherapy. Indeed, the administration of an immune checkpoint blockade greatly diminished tumor growth. To corroborate these data in humans, we analyzed publicly available databases of transcriptomic data and indeed found a correlation between the expression of T cell chemotactic factors and patient survival. Overall, our data suggest that the inhibition of the Cn-NFAT axis can enhance existing immunotherapies.
GRANUCCI, FRANCESCA
Tumori freddi; Calcineurina; NFAT; Cellule T CD8; Immunoterapia
Cold tumors; Calcineurin; NFAT; CD8 T cells; Immunotherapy
MED/04 - PATOLOGIA GENERALE
English
23-feb-2023
MEDICINA TRASLAZIONALE E MOLECOLARE - DIMET
35
2021/2022
embargoed_20260223
(2023). Role of tumor-intrinsic calcineurin in shaping the tumor microenvironment and regulating the cytotoxic T cell response. (Tesi di dottorato, Università degli Studi di Milano-Bicocca, 2023).
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Descrizione: Role of tumor-intrinsic calcineurin in shaping the tumor microenvironment and regulating the cytotoxic T cell response
Tipologia di allegato: Doctoral thesis
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/10281/405199
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