Functions and regulation of the MRX and Ku protein complexes at DNA ends

Genome instability is one of the hallmarks of cancer cells and it can be caused by DNA repair defects. Among several types of DNA damage, DNA double-strand breaks (DSBs) are highly cytotoxic lesions that can form accidentally during DNA replication or upon exposure to genotoxic agents. DSBs must be repaired to avoid loss of genetic information and to ensure genomic stability. Eukaryotic cells repair DSBs by activating the DNA damage response (DDR) and by using two main mechanisms: non-homologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). The cellular response to DSBs is initiated by the recruitment of Ku (Ku70-Ku80) and MRX/N (Mre11-Rad50-Xrs2/Nbs1) complexes at the two DSB broken ends. MRX in turn recruits Tel1/ATM, a kinase involved in the DNA damage checkpoint, a surveillance mechanism that couples DSB repair and cell-cycle progression. Tel1 allows to promote and stabilize MRX association at both DSBs and telomeres in a positive feedback loop. Ku, MRX/MRN, and Tel1/ATM are also required to maintain the length of telomeres, specialized nucleoprotein complexes at the ends of eukaryotic chromosomes. Furthermore, telomeric DNA must be distinguished from intrachromosomal DSBs ends through different protein complexes, which are recruited to telomeres in order to prevent DDR activation. In S. cerevisiae, Rif2 and Rap1 are two of the main proteins that compose these complexes. Both Rif2 and Rap1 counteract Tel1 activation, nucleolytic degradation, and NHEJ at telomeres. Rif2 appears to exert all these functions by inhibiting MRX association with telomeric DNA, however how Rap1 negatively controls MRX activity at DNA ends remained to be determined. In the first part of my PhD, I contributed to show that Rif2 counteracts MRX association at both DSBs and telomeres in a Rap1-dependent manner. Rap1 in turn can inhibit MRX functions in a Rif2-dependent and -independent manner, and Rap1 functions at DNA ends are influenced by its DNA binding mode. An important issue in NHEJ is the maintenance of the DSB ends in close proximity to allow their correct re-ligation. This function is called end-tethering and some data in E.coli suggested an involvement of the Ku complex in this control mechanism. However, a Ku role in end-tethering remained to be determined. In the second part of my PhD, I investigated this issue by generating a Ku70 mutant variant that increases Ku persistence at DSBs. The characterization of the ku70-C85Y allele has allowed to show that the Ku complex promotes DSB end-tethering and the C85Y mutation enhances this bridging function by increasing Ku retention very close to the DSB ends. The function of Ku in DSB end-tethering is also regulated by Tel1/ATM, which antagonizes this Ku function by limiting Ku persistence at the DSB ends. As the presence of Ku at the DSB ends prevents the access of resection nucleases, the Tel1-mediated regulation of Ku association with the DSB ends provides an important layer of control in the choice between NHEJ and HR mechanism, suggesting a new function of Tel1 in the DNA damage response. All these findings contributed to elucidate the molecular mechanisms that modulate DNA repair and maintain genome stability in response to DSBs, with a specific focus on the functions and regulation of MRX and Ku complexes.

L'instabilità del genoma è una delle caratteristiche delle cellule tumorali e può essere causata da difetti nella riparazione del DNA. In particolare, le rotture del doppio filamento del DNA (DSBs) sono lesioni altamente citotossiche che possono formarsi accidentalmente durante la replicazione del DNA o in seguito all'esposizione ad agenti genotossici, e devono essere correttamente riparate al fine di garantire la stabilità genomica. Per far fronte a queste lesioni del DNA, le cellule eucariotiche attivano la risposta al danno del DNA (DDR) e utilizzano due meccanismi principali per la riparazione dei DSBs: l’unione terminale non omologa (NHEJ) e la ricombinazione omologa (HR). La risposta cellulare ai DSBs ha inizio con il reclutamento dei complessi Ku e MRX/MRN alle due estremità rotte di un DSB. Inoltre, il complesso MRX recluta al DSB anche Tel1/ATM, una chinasi coinvolta nel checkpoint da danno al DNA. Tel1, a sua volta, consente di promuovere e stabilizzare l'associazione del complesso MRX sia ai DSBs che ai telomeri in un ciclo a feedback positivo. Ku, MRX/MRN e Tel1/ATM sono anche necessari per mantenere la lunghezza dei telomeri, strutture nucleoproteiche specializzate situate alle estremità dei cromosomi eucariotici. Il DNA telomerico deve inoltre essere distinto dalle estremità dei DSBs intracromosomici attraverso diversi complessi proteici, i quali vengono reclutati ai telomeri al fine di prevenire l'attivazione della DDR. Nel lievito S. cerevisiae, Rif2 e Rap1 costituiscono due delle principali proteine che compongono tali complessi. Sia Rif2 che Rap1 contrastano l'attivazione di Tel1, la degradazione nucleolitica e l’unione terminale non omologa ai telomeri. Rif2 sembra esercitare tutte queste funzioni inibendo l'associazione del complesso MRX al DNA telomerico; tuttavia, restava ancora da determinare come Rap1 controllasse negativamente l'attività di MRX alle estremità del DNA. Nella prima parte del mio dottorato di ricerca, ho contribuito a dimostrare che Rif2 contrasta l'associazione del complesso MRX sia ai DSBs che ai telomeri in modo dipendente da Rap1. Rap1, a sua volta, può inibire le funzioni di MRX in modo sia dipendente sia indipendente da Rif2, e le funzioni di Rap1 alle estremità del DNA sono influenzate dalle modalità con cui questa proteina lega il DNA. In merito al NHEJ, una questione importante è rappresentata dal mantenimento delle estremità di un DSB in stretta prossimità fra loro, necessario per consentire una corretta rilegatura. Questa funzione è chiamata end-tethering e sebbene alcuni dati in E.coli abbiano suggerito un coinvolgimento del complesso Ku in questo meccanismo di controllo, restava ancora da chiarire quale fosse il suo esatto ruolo nell’end-tethering. Nella seconda parte del mio dottorato, ho quindi studiato questa problematica tramite la generazione di una variante mutante della proteina Ku70 in grado di aumentare la persistenza del complesso Ku ai DSBs. La caratterizzazione dell'allele ku70-C85Y ha consentito di dimostrare che il complesso Ku promuove l’end-tethering del DNA e la mutazione C85Y migliora tale funzione aumentando la ritenzione di Ku in stretta prossimità alle estremità di un DSB. Inoltre, la funzione svolta da Ku nel DSB end-tethering è regolata da Tel1/ATM, che antagonizza tale funzione del complesso Ku limitandone la persistenza alle estremità dei DSBs. Poiché la presenza del complesso Ku alle estremità dei DSBs impedisce l'accesso delle nucleasi di resezione, la regolazione dell'associazione di Ku alle estremità rotte del DNA mediata da Tel1 fornisce un importante livello di controllo nella scelta tra il meccanismo di NHEJ e di HR, suggerendo una nuova funzione di Tel1 nella risposta al danno al DNA. Tutti questi risultati hanno contribuito a chiarire i meccanismi molecolari che modulano la riparazione del DNA in risposta ai DSBs, con un focus specifico sulle funzioni e sulla regolazione dei complessi MRX e Ku.