Functions and regulation of the MRX complex at DNA double strand breaks

DNA double strand breaks (DSBs) are among the most severe DNA lesions. If not properly repaired, DSBs could lead to loss of genetic information and genome instability, which is one of the hallmarks of cancer cells. Eukaryotic cells repair DSBs by non-homologous end joining (NHEJ), which directly re-ligates the DNA broken ends, and homologous recombination (HR), which uses the intact homologous DNA sequence as a template to repair the DSB. HR requires a nucleolytic degradation of the broken DNA ends, in a process called resection. In Saccharomyces cerevisiae, the MRX (Mre11, Rad50 and Xrs2) complex, aided by Sae2, initiates resection of the DSB ends by performing an endonucleolytic cleavage on the 5’-ended strands. This cleavage, catalyzed by the Mre11 subunit, allows the access of Exo1 and Dna2 nucleases that elongate the ssDNA ends. In NHEJ, the two broken ends need to be physically connected to allow their correct religation. This function, called end tethering, depends on the Rad50 subunit, which binds and hydrolyses ATP. A transitions between an ATP-bound state to a post-hydrolysis cutting state regulates MRX DNA binding and processing activities. The MRX complex is also essential in DNA damage checkpoint activation because it recruits the checkpoint kinase Tel1 at the break site. In this thesis, we studied functions and regulation of the MRX complex in DSB repair. We found mre11 alleles that suppress the hypersensitivity of sae2Δ cells to genotoxic agents. The mutations in the Mre11 N-terminus suppress the resection defect of sae2Δ cells by lowering MRX and Tel1 association to DSBs. The diminished Tel1 persistence potentiates Dna2 resection activity by decreasing Rad9 association to DSBs. By contrast, the mre11 mutations localized at the C-terminus bypass Sae2 function in end-tethering but not in DSB resection, possibly by destabilizing the Mre11–Rad50 open conformation. These findings unmask the existence of structurally distinct Mre11 domains that support resistance to genotoxic agents by mediating different processes. In vitro Tel1 activation by MRX requires ATP binding to Rad50, suggesting a role for the MR subcomplex in Tel1 activation. In this thesis, we describe two separation-of-functions alleles, mre11-S499P and rad50-A78T, which we show to specifically affect Tel1 activation without impairing MRX functions in DSB repair. Both Mre11-S499P and Rad50-A78T reduce Tel1–MRX interaction leading to low Tel1 association at DSBs that reduces Tel1 activation. Molecular dynamics simulations show that the wild type MR subcomplex bound to ATP lingers in a tightly ‘closed’ conformation, while ADP presence leads to the destabilization of Rad50 dimer and of Mre11–Rad50 association, both events being required for MR conformational transition to an open state. By contrast, MRA78T undertakes complex opening even if Rad50 is bound to ATP, indicating that defective Tel1 activation caused by MRA78T results from destabilization of the ATP- bound conformational state. The lack of Sae2 increases MRX persistence at DSBs and checkpoint activation. In this thesis, we also show that the telomeric protein Rif2, which stimulates ATP hydrolysis by Rad50, inhibits the Mre11 endonuclease activity and is responsible for the increased MRX retention at DSBs in sae2Δ cells. We identified a Rad50 residue that is important for Rad50-Rif2 interaction and Rif2-mediated inhibition of Mre11 nuclease. This residue is located nearby a Rad50 surface that binds Sae2 and is important to stabilize the Mre11-Rad50 interaction in the cutting state. We propose that Sae2 stimulates MRX endonuclease activity by stabilizing the cutting state, whereas Rif2 inhibits it by antagonizing Sae2 binding to Rad50 and stabilizing a MR conformation that is not competent for DNA cleavage. The results described in this PhD thesis contribute to the understanding of the molecular mechanisms supporting functions and regulation of the MRX complex at DSBs.

Le rotture del doppio filamento del DNA (DSB) sono tra le lesioni del DNA le più gravi. Se non adeguatamente riparati, i DSB potrebbero portare alla perdita di informazioni genetiche e all'instabilità del genoma, che è uno dei tratti distintivi delle cellule tumorali. Le cellule eucariotiche riparano i DSB mediante il non-homologous end joining (NHEJ), che ricongiunge direttamente le estremità rotte del DNA e la ricombinazione omologa (HR), che utilizza la sequenza di DNA omologa per riparare il DSB. L'HR richiede una degradazione nucleolitica delle estremità, in un processo chiamato resection. In Saccharomyces cerevisiae, il complesso MRX (Mre11, Rad50 e Xrs2), aiutato da Sae2, avvia il processamento delle estremità del DSB eseguendo un taglio sulle estremità 5'. Questo taglio, catalizzato dalla subunità Mre11, consente l'accesso alle nucleasi Exo1 e Dna2. Nel NHEJ, le due estremità devono essere collegate per consentire la loro corretta riparazione. Questa funzione, chiamata end tethering, dipende dalla subunità Rad50, che lega e idrolizza l'ATP. Una transizione da uno stato legato all'ATP a uno stato di taglio post-idrolisi regola le attività di associazione e processamento del DNA di MRX. Il complesso MRX è essenziale anche nell'attivazione del checkpoint perché recluta la chinasi del checkpoint Tel1 al DSB. In questa tesi, abbiamo studiato le funzioni e la regolazione del complesso MRX nella riparazione dei DSB. Abbiamo trovato degli alleli mre11 che sopprimono l'ipersensibilità delle cellule sae2Δ agli agenti genotossici. Le mutazioni nell'N-terminale di Mre11 sopprimono il difetto di resection delle cellule sae2Δ riducendo l'associazione di MRX e Tel1 al DSB. La ridotta persistenza di Tel1 potenzia l'attività di resection di Dna2 diminuendo l'associazione di Rad9 al DSB. Al contrario, le mutazioni di mre11 localizzate nel C-terminale non necessitano di Sae2 nel tethering ma non nella resection, possibilmente destabilizzando la conformazione aperta di Mre11 - Rad50. Questi risultati mostrano l'esistenza di domini Mre11 strutturalmente distinti che supportano la resistenza agli agenti genotossici mediando diversi processi. L'attivazione di Tel1 in vitro da parte di MRX richiede il legame dell'ATP a Rad50. In questa tesi, descriviamo due alleli, mre11-S499P e rad50-A78T, che influenzano l'attivazione di Tel1 senza compromettere le funzioni MRX nella riparazione DSB. Queste due varianti riducono l'interazione Tel1-MRX portando a una bassa associazione Tel1 ai DSB che ne riduce l'attivazione. Le simulazioni di dinamica molecolare mostrano che il sub-complesso MR wild-type legato all'ATP rimane in una conformazione 'chiusa', mentre la presenza di ADP porta alla destabilizzazione del dimero Rad50 e dell'associazione Mre11-Rad50, entrambi gli eventi sono richiesti per la transizione conformazionale MR ad uno stato aperto. Al contrario, MRA78T provoca un'apertura del complesso anche se legato all'ATP, indicando che il difetto di attivazione di Tel1 causato da MRA78T risulta dalla destabilizzazione dello stato conformazionale legato all'ATP. La mancanza di Sae2 aumenta la persistenza di MRX ai DSB e all'attivazione dei checkpoint. In questa tesi, dimostriamo anche che la proteina telomerica Rif2, che stimola l'idrolisi dell'ATP da parte di Rad50, inibisce l'attività dell'endonucleasi Mre11 ed è responsabile dell’aumento di MRX ai DSB nelle cellule sae2Δ. Abbiamo identificato un residuo di Rad50 che è importante per l'interazione Rad50-Rif2 e l'inibizione mediata da Rif2 della nucleasi Mre11. Questo residuo altera l'interazione Mre11-Rad50. Proponiamo che Sae2 stimoli l'attività endonucleasica di MRX stabilizzando lo stato di taglio, mentre Rif2 lo inibisce antagonizzando il legame di Sae2 e stabilizzando una conformazione di MR che non è adatta al taglio.