Unconventional purification and labelling strategies of bioreagents for immunodiagnostic assays

Antigens and antibodies are key reagents for the development of accurate, reproducible and sensible immunodiagnostic assays, which are widely used for the detection of infectious diseases (HIV,HBV, HCV, etc.) and the determination of biological markers (vitamins, hormones, etc.). These bioreagents need to be produced at a high purity degree, in stable formulations and with sufficient reproducibility over time (lot to lot consistency). An aspect often overlooked in the production of these reagents is their cost, which must be low enough to not have a significant impact on the final price of the immunochemical assays. The purification and labeling steps of these bioreagents mainly affect the overall cost of them since costly reagents and instrumentations and complex and time-consuming protocols are used.For all these reasons it is important to seek new purification strategies that allow the development of simpler processes, with less use of reagents and shorter protocol times, and at the end minor costs. Therefore, it is necessary to develop innovative purifications and site-specific labelling protocols. In the first part of this project we exploited the ELP-intein system. This method is based on the combination of two technological tools, the Elastin-like-polypeptides (ELPs) (a physico-chemical tool) and the MxeGyrA intein activity (a biochemical tool), belonging to the cis intein family. We focused on the purification and labelling of the C33 antigen from Hepatitis C Virus (HCV). The C33 antigen, which is currently used in the Diasorin LIAISON® XL Murex HCV assay for the detection of human antibodies against the Hepatitis C Virus, was purified using a not conventional purification method without chromatographic steps. Moreover, we realized a site-specific biotinylation of C33 antigen at its C-terminus during the purification exploiting the MxeGyrA intein biological activity. Two different protocols were developed; both of them brought to the obtainment of a biotinylated C33 antigen with high purity and a comparable immunoreactivity with the one currently used in the Diasorin LIAISON® XL Murex HCV assay. In light of these good results, in the second part of the project, we investigated the possibility to apply the Protein Trans Splicing (PTS) technology to perform site-specific labelling of bioreagents. PTS technology exploits the split intein activity. In particular, in our experiments we used the Cfa split-intein which derives from a mutagenesis process of the natural Npu split-intein that significantly improved its kinetic of PTS, thermal stability and tolerance at the chaotropic agents. This new technique allowed us to set up a site-specific labelling protocol for the production of biotinylated bioreagents. Two model protein were used: the same C33 antigen and a recombinant human IgG. Also the use of PTS technique permitted to obtain for both of two proteins a high purity and a comparable performance in the immunoassays. In summary, the ELP-intein system allowed to purify the C33 antigen without chromatographic steps and then to site-specific label the same protein at the C-terminus. Moreover, through the use of the Cfa split-intein system we obtained the site-specific biotinylation of the C33 antigen and the recombinant IgG. A very relevant aspects is that all these proteins are functional in the LIAISON platform. In the future, these protocols could be used for the purification and-or the site-specific labelling of new bioreagents useful for the development of immunodiagnostic assays.

Gli antigeni e gli anticorpi sono reagenti chiave per lo sviluppo di test immunodiagnostici accurati, riproducibili e sensibili, ampiamente utilizzati per la rilevazione di malattie infettive (HIV, HBV, HCV, ecc.) e per la determinazione di marcatori biologici (vitamine, ormoni, ecc.). Questi bioreagenti devono essere prodotti con un alto grado di purezza, in formulazioni stabili e con sufficiente riproducibilità nel tempo (consistenza da lotto a lotto). Un aspetto spesso trascurato nella produzione di questi reagenti è il loro costo, che deve essere sufficientemente basso da non avere un impatto significativo sul prezzo finale dei saggi immunochimici. Le fasi di purificazione e di marcatura di questi bioreagenti incidono principalmente sul loro costo complessivo poiché vengono utilizzati reagenti e strumentazioni costosi e protocolli complessi che richiedono tempo. Per tutti questi motivi è importante ricercare nuove strategie di purificazione che permettano lo sviluppo di processi più semplici, con minor quantità di reagenti, in tempi più brevi, in modo da ridurre i costi. Pertanto, è necessario sviluppare purificazioni innovative e protocolli di marcatura sito-specifici. Nella prima parte di questo progetto abbiamo sfruttato il sistema ELP-intein. Questo metodo si basa sulla combinazione di due tools tecnologici, Elastin-like-polypeptides (ELP) (tool fisico-chimico) e l'attività dell’inteina MxeGyrA (tool biochimico), appartenente alla famiglia delle cis inteine. Ci siamo concentrati sulla purificazione e la marcatura dell'antigene C33 appartenente al virus dell'epatite C (HCV). L'antigene C33, attualmente utilizzato nel test Diasorin LIAISON® XL Murex HCV per la rilevazione di anticorpi umani contro il virus dell'epatite C, è stato purificato utilizzando un metodo non convenzionale senza passaggi cromatografici. Inoltre, abbiamo realizzato una biotinilazione sito-specifica dell'antigene C33 al suo C-terminale durante la purificazione, sfruttando l'attività biologica inteina di MxeGyrA. Sono stati sviluppati due diversi protocolli; entrambi hanno portato all'ottenimento di un antigene C33 biotinilato con un’elevata purezza e immunoreattività paragonabile a quella dell’antigene attualmente utilizzato nel saggio Diasorin HCV. Alla luce di questi buoni risultati, nella seconda parte del progetto, abbiamo studiato la possibilità di applicare la tecnologia del Protein Trans Splicing (PTS) per eseguire la marcatura sito-specifica di bioreagenti. La tecnologia PTS sfrutta l'attività delle split inteine. In particolare, nei nostri esperimenti abbiamo utilizzato la Cfa split-intein che deriva da un processo di mutagenesi della split-intein naturale Npu che ne ha notevolmente migliorato la cinetica di PTS, stabilità termica e tolleranza agli agenti caotropici. Questa nuova tecnica ci ha permesso di impostare un protocollo di marcatura sito-specifica per la produzione di bioreagenti biotinilati. Sono state utilizzate due proteine modello: lo stesso antigene C33 e una IgG umana ricombinante. Anche l'uso della tecnica PTS ha permesso di ottenere per entrambe le due proteine un'elevata purezza e prestazioni comparabili nei relativi saggi immunodiagnostici. In sintesi, il sistema ELP-inteina ha permesso di purificare l'antigene C33 senza passaggi cromatografici e di marcare in modo sito-specifico la stessa proteina al C-terminale. Inoltre, attraverso l'utilizzo del sistema Cfa split-intein abbiamo ottenuto la biotinilazione sito-specifica dell'antigene C33 e dell'IgG ricombinante. Un aspetto molto rilevante è che tutte queste proteine sono funzionali nella piattaforma LIAISON. In futuro, questi protocolli potrebbero essere utilizzati per la purificazione e / o la marcatura sito-specifica di nuovi bioreagenti utili per lo sviluppo di saggi immunodiagnostici.