In vitro and in vivo characterization of resistance to lorlatinib treatment in ALK mutated cancers

Targeted therapy changed the standard of care in ALK-dependent tumors. However, resistance remains a major challenge. Lorlatinib is a third-generation ALK inhibitor that inhibits most ALK mutants resistant to current ALK inhibitors. In this study, we utilize lorlatinib-resistant anaplastic large cell lymphoma (ALCL), non–small cell lung cancer (NSCLC), and neuroblastoma cell lines in vitro and in vivo to investigate the acquisition of resistance and its underlying mechanisms. ALCL cells acquired compound ALK mutations G1202R/G1269A and C1156F/L1198F in vitro at high drug concentrations. ALCL xenografts selected in vivo showed recurrent N1178H (5/10 mice) and G1269A (4/10 mice) mutations. Interestingly, intracellular localization of NPM/ALKN1178H skewed toward the cytoplasm in human cells, possibly mimicking overexpression. RNA sequencing of resistant cells showed significant alteration of PI3K/AKT and RAS/MAPK pathways. Functional validation by small-molecule inhibitors confirmed the involvement of these pathways in resistance to lorlatinib. NSCLC cells exposed in vitro to lorlatinib acquired hyperactivation of EGFR, which was blocked by erlotinib to restore sensitivity to lorlatinib. In neuroblastoma, whole-exome sequencing and proteomic profiling of lorlatinib-resistant cells revealed a truncating NF1 mutation and hyperactivation of EGFR and ErbB4. These data provide an extensive characterization of resistance mechanisms that may arise in different ALK-positive cancers following lorlatinib treatment.

La terapia personalizzata ha cambiato lo scenario clinico dei tumori ALK-positivi. Tuttavia, la resistenza farmacologica rimane un ostacolo importante cui far fronte. Lorlatinib è un farmaco di terza generazione che inibisce la maggior parte dei mutanti di ALK resistenti agli attuali inibitori. In questo studio sono state utilizzate in vitro e in vivo linee cellulari resistenti a lorlatinib derivanti da linfoma anaplastico a grandi cellule (ALCL), carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC) e neuroblastoma, allo scopo di studiare i meccanismi che guidano l'acquisizione della resistenza. In vitro, cellule di ALCL trattate con alte concentrazioni di lorlatinib hanno acquisito le seguenti mutazioni composte di ALK: G1202R/G1269A e C1156F/L1198F. In vivo, Le cellule di ALCL xenotrapiantate in topi immunocompromessi hanno acquisito le seguenti mutazioni ricorrenti: N1178H (5 topi su 10) e G1269A (4 topi su 10). È interessante notare che nelle cellule umane, dove l’espressione di NPM/ALK è tipicamente nucleare, la presenza della mutazione induce la localizzazione citoplasmatica di NPM/ALKN1178H, probabilmente mimandone l’overespressione. Nelle cellule resistenti si è osservata una significativa alterazione dei pathway di PI3K/AKT e RAS/MAPK, come dimostrato dall’analisi dell’espressione genica tramite RNA-seq. Il coinvolgimento di questi pathway nella resistenza a lorlatinib è stato confermato dalla validazione funzionale con inibitori. Le cellule di NSCLC trattate in vitro con lorlatinib hanno acquisito iperattivazione di EGFR. Il trattamento con un inibitore di EGFR, erlotinib, , è stato in grado di ripristinare la sensibilità a lorlatinib. In cellule di neuroblastoma resistenti a lorlatinib, il sequenziamento dell'intero esoma e l’analisi proteomica hanno rivelato una forma tronca di NF1 e l’iperattivazione di EGFR e ErbB4. Questi dati forniscono un'ampia caratterizzazione dei meccanismi di resistenza che possono insorgere in diversi tumori ALK-positivi dopo il trattamento con lorlatinib.