Characterization of the role of mutated ETNK1 in the onset of atypical Chronic Myeloid Leukemia

Atypical chronic myeloid leukemia (aCML) is a clonal disorder belonging to the MDS/MPN syndromes. About 13% of aCML cases carry somatic mutations in ETNK1 gene, encoding for H243Y, N244S and G245V substitutions. We previously showed that, in both ETNK1-positive aCML primary samples and TF1 cells transduced with mutated ETNK1, the mutations lead to an impairment of ETNK1 enzymatic activity, responsible for a decrease in the intracellular level of phosphoethanolamine (P-Et). To dissect the functional role of ETNK1 mutations I created a new isogenic CRISPR/Cas9 cellular model in which ETNK1 N244S mutation was present as heterozygous variant, and I investigated the functional effect of P-Et modulation by a combined approach involving metabolomics, lipidomics, whole-transcriptome sequencing, ChIP and mitochondria respiration analyses, showing that it causes (i) increased mitochondria potential, (ii) change in mitochondria morphology, (iii) increased ROS production, (iv) increased gDNA mutation rate. I also showed that the increased mitochondrial activity in presence of ETNK1 mutations is caused by a direct competition between P-Et and succinate for complex II succinate dehydrogenase enzyme. Finally, experiments focused on the reconstruction of the hierarchy of somatic mutations in aCML patients showed that ETNK1 somatic mutations are early events in the subclonal history of aCML, which fits with a role of ETNK1 as an inducer of a mutant phenotype, which in turn would accelerate the accumulation of further oncogenic mutations.

La leucemia mieloide cronica atipica (aCML) è un disordine clonale appartenente al gruppo delle sindromi mielodisplastiche/mieloproliferative (MDS/MPN). Circa il 13% dei casi di aCML è caratterizzato dalla presenza di mutazioni somatiche a carico del gene ETNK1, codificanti per le sostituzioni amminoacidiche H243Y, N244S e G245V. Precedentemente, abbiamo dimostrato che sia in campioni primari di aCML ETNK1-positiva sia nella linea cellulare TF1 trasdotta con ETNK1 mutato, le mutazioni causano una diminuzione dell’attività enzimatica di ETNK1, causando una riduzione nei livelli intracellulari di fosfoetanolamina (P-Et). Per caratterizzare il ruolo funzionale delle mutazioni di ETNK1, ho creato un nuovo modello cellulare isogenico CRISPR/Cas9 nel quale la mutazione N244S è presente come variante in eterozigosi, e ho studiato l’effetto funzionale della modulazione di P-Et applicando diverse strategie, tra cui approcci di metabolimica, lipidomica, analisi di espressione genica, ed esperimenti di respirazione mitocondriale, dimostrando che la mutazione di ETNK1 (i) causa un aumento del potenziale di membrana mitocondriale, (ii) un cambiamento della morfologia mitocondriale, (iii) un aumento della produzione di ROS, (iv) e aumenta il tasso di mutazioni al DNA genomico. Inoltre, ho dimostrato che l’aumentata attività mitocondriale causata dalla mutazione di ETNK1 è dovuta a una diretta competizione tra P-Et e succinato per l’enzima succinato deidrogenasi (complesso II). Infine, esperimenti di ricostruzione della gerarchia clonale delle mutazioni somatiche nei pazienti affetti da aCML indicano che le mutazioni di ETNK1 sono eventi precoci nel processo evolutivo della patologia, suggerendo per ETNK1 un ruolo di induttore di un fenotipo mutante, il quale a sua volta contribuisce all’accumulo di ulteriori mutazioni oncogeniche.