Computational modelling of macromolecules: prediction of the 3-D structure, catalytic activity and dynamic features of proteins

In this work I used different computational techniques, in particular QM and MM methods, to study the relation between structure and activity. The first project was the characterization under structural point of view of the FeMo-cofactor presents in the active site of nitrogenase. My work was focused on the structural characterization of the key cofactor state E4 , that is now accepted as the intermediate that bind N2 in the active site. For this purpose, DFT simulations have been performed on the FeMo-co active site considering all the iron oxidation state assignments proposed in literature ([ 5Fe III :2Fe II ]; [ 3Fe III :4Fe II ]; [ 1Fe III :6Fe II ]) with protonated and not protonated forms of homocitrate. Only in cases of [ 3F e III :4F e II ] with protonated form of homocitrate the optimized E 4 structure shows two hydrides bridged to the same iron atoms (Fe6 and Fe7 ) in an orthogonal fashion, consistently with experimental data. I have also studied the electronic properties of E 4 intermediate in order to evaluate the spin alignment of ferrous and ferric sites, with peculiar focus on the two Fe ions sharing hydride ligands. DFT broken symmetry calculations showed a parallel spin-coupling pattern for the two iron atoms (↑Fe6 : ↑Fe7 ). Another issue investigated is the effect of the substitution of Ar g 96 → Gln on the resting state of the MoFe protein. Experimental evidences show that in presence of this mutation the active site of nitrogenase is able to (non-covalently) bind acetylene even in the resting state (whereas WT protein cannot). To rationalize the observed behaviour, DFT approach has been used to evaluate the binding energy between acetylene and FeMo-co active site in the cases of mutant and wild type systems. In line with experiments, the binding energy results more favourable for the mutant than for the wild type enzyme. An explanation can be found in the different chemico-physical properties of the region available for acetylene binding in cofactor proximity: in presence of the substitution Ar g 96 → Gln the pocket environment becomes more hydrophobic than in the wild type case. Considering the nonpolar nature of acetylene, the mutated MoFe protein has therefore active site features that make it more suitable for substrate binding. The second project was the characterization of the hydrolytic mechanism of a de novo design peptide TRIL9CL23H (an analogue of carbonic anhydrase) trough DFT calculations and identification of a possible binding site for substrates using flexible docking. The mechanism proposed for TRIL9CL23H is a merge of α-anhydrase and β-anhydrase ones: as in α-anhydrase there is a zinc coordinated by three histidine residues and a water molecule, as in β-anhydrase a glutamate residue accepts the water’s proton from active site. Contrary to carbonic anhydrase, results show that the rate determining step is the release of the products from active site and not the activation of water. According to docking results the binding site is located on the side of proteins close to the active site. The last project has investigated the effect of the R10T amino acid change in the Mre11 protein which causes a rapid DSB resection. The wild type and the mutated dimer of Mre11 were studied trough molecular dynamics simulations. Results pointed out that the R10T substitution alters the mobility of the capping domain of Mre11, movement that is implicated in DNA unwinding. This mutation augments the rotation of the capping domain that can lead to a better DNA unwind activity. In this way nucleases that are involved in the DSB resection can have a better access to the DNA.

Durante il mio PhD ho utilizzato diverse tecniche computazionali, in particolare metodi QM e MM, per studiare la relazione struttura/attività delle proteine. Il primo progetto consiste nella caratterizzazione strutturale del cofattore metallico FeMo-co presente nel sito attivo delle Mo-nitrogenasi. L'obbiettivo è studiare da un punto di vista strutturale l'intermedio E 4 che è attualmente ritenuto essere lo step nel quale avviene il legame con N 2 . A tale scopo sono state svolte simulazioni DFT sul FeMo-co considerando ogni possibile stato redox dei ferri proposto in letteratura ( [5FeIII:2FeII]; [3FeIII:4FeII]; [1FeIII:6FeII]) e la forma protonata e non protonata dell'omocitrato. Solo con la configurazione [3FeIII:4FeII] e con l'omocitrato protonato la struttura ottimizzata di E4 mostra la presenza di due idruri a ponte disposti in modo ortogonale tra loro e legati entrambi ai medesimi atomi di ferro (Fe6 e Fe7 ) in accordo con i dati EPR. Tramite Broken Symmetry si è studiato anche il corretto allineamento di spin dei vari atomi di ferro con particolare riguardo per i due ferri (Fe6 e Fe7) che legano gli idruri. Un altro aspetto studiato riguardante le Mo-nistrogenasi è stata la caratterizzazione della mutazione Ar g 96→Gln . Tale sostituzione rende possibile il binding dell'acetilene al sito attivo delle nitrogenasi anche durante il resting state E0 . Per tentre di dare una spiegazione a tale fatto, si è calcolata l'energia di binding dell'acetilene sia per sito attivo wild type che per quello mutato tramite simulazioni DFT. L'energia di binding dell'acetilene risulta essere più favorevole per il mutante che per il wild type in linea con i dati sperimentali. Dalle simulazioni effettuate risulta che la sostituzione Arg 96 → Gln altera le proprietà chimico-fisiche della tasca di legame, in particolare tale mutazione ha l'effetto di aumentare le caratteristiche idrofobiche del sito di binding. Considerando la natura apolare dell'acetilene, l'aumento del carattere idrofobico dell'intorno aminoacidico del FeMo-co spiega bene il motivo del binding anche durante il resting state E0 . Il secondo progetto è la caratterizzazione del meccanismo catalitico di un enzima di de novo design tramite simulazioni DFT e di docking molecolare. La proteina presa in considerazione è TRIL9CL23H, un analogo dell'anidrasi carbonica. Il meccanismo catalitico proposto per TRIL9CL23H risulta essere una combinazione dei meccanismi catalitici della α-anidrasi e della β-anidrasi: come accade nel α-anidrasi il sito attivo è costituito da una molecola di acqua coordinata ad un atomo di zinco, a sua volta coordinato con geometria tetraedrica a tre istidine; come accade invece nella β-anhydrase l'accettore del protone perso dalla molecola d'acqua coordinata allo zinco risulta essere un glutammato. I risultati mostrano che a differena dell'anidrasi carbonica, dove il passaggio limitante è l'attivazione della molecola d'acqua, nel caso di TRIL9CL23H il collo di bottiglia di tutto il processo catalitico risulta essere l'uscita dei prodotti dal sito attivo dell'enzima. Nell'ultimo progetto si è studiato l'effetto della sostituzione R10T della subuità Mre11 del complesso MRX. L'obbiettivo di questo studio è quello di caratterizzare l'effetto di questa sostituzione utilizzando tecniche di simulazione di dinamica molecolare (MD). L'analisi delle dinamiche ha mostrato che la sostituzione R10T provoca una diversa disposizione spaziale del capping domain di Mre11 che ha come effetto quello di aumentare l'attività di svolgimento del DNA. Questa aumentata predisposizione di Mre11-R10T ad aprire la doppia elica di DNA garantendo così alle nucleasi un più facile accesso, spiega l'aumentata attività di resection osservata sperimentalmente.