Lipopolysaccharide transport and peptidoglycan remodeling: two related processes in Escherichia coli.

The cell envelope of Gram-negative bacteria is a complex multi-layered structure consisting of a cytoplasmic and an outer membrane (CM and OM), which delimit the periplasm containing a thin layer of peptidoglycan (PG) called the sacculus. The primary function of the OM is to establish a selective permeability barrier that enables the cell to maintain favourable intracellular conditions even in hash environments and the lipopolysaccharide (LPS) layer greatly contributes to this peculiar property. The integrity of the PG mesh is essential to protect the cell from bursting due to its turgor and maintain the shape of the cell. OM and PG are synthetized and assembled by multiprotein machineries that need to be finely coordinated as imbalanced growth of these layers may compromise structural integrity of the cell. In order to gain more insight in the mechanism by which the cells coordinate the growth of these two layers, we analysed the PG composition when the biogenesis of OM is compromised due to the block of LPS transport. In this work we shown that when OM is impaired, E. coli cells remodel PG architecture by increasing the non-canonical 3- 3 cross-linkage. We can assume that this is a salvage mechanism to prevent cell lysis when OM is damaged.

Il rivestimento dei batteri Gram negativi consiste in una membrana interna (IM) e una membrana esterna (OM) separate da uno spazio periplasmatico contenente un sottile strato di peptidoglicano (PG) ancorato alla OM tramite la lipoproteina di Braun (LPP). Mentre la IM è costituita da un doppio strato di fosfolipidi, la OM è una membrana lipidica asimmetrica, contenente fosfolipidi nel foglietto interno, e un lipide complesso il Lipopolisaccaride (LPS) nel foglietto esterno. Il LPS sintetizzato nel citoplasma, viene traslocato sul lato periplasmatico della IM e preso in carico dal complesso multiproteico Lpt (LPS transport), composto in Escherichia coli da sette proteine essenziali (Lpt ABCDEFG) che si occupano del suo trasporto fino al raggiungimento della sua sede finale, la OM. Analisi biochimiche hanno dimostrato che le sette proteine Lpt formano un complesso “transenvelope” che connette IM e OM e studi di tipo genetico suggeriscono che esse operino in concerto come un singolo macchinario. Infatti, la deplezione di un qualsiasi componente del complesso Lpt causa lo stesso fenotipo, ovvero l’accumulo del LPS nel versante periplasmatico della IM, la decorazione del LPS con acido colanico e la formazione di una IM anomala, con una densità intermedia tra la IM e la OM. Nel nostro laboratorio è stata condotta l’analisi differenziale del proteoma delle membrane totali di E. coli in deplezione di LptC, per studiare la risposta globale al blocco del trasporto del LPS. Tra le proteine il cui livello cambia nel confronto tra il ceppo non depleto e il depleto sono state trovate proteine coinvolte nella biogenesi e nel rimodellamento del PG. Lo scopo di questa tesi è stato lo studio della correlazione tra il blocco del LPS e il rimodellamento del PG. Inizialmente è stata analizzata la struttura del PG in deplezione di LptC. Questa analisi ha evidenziato che in questa condizione la struttura del PG varia sia per composizione che per tipo di legami crociati tra i filamenti glicanici adiacenti. Nei batteri Gram negativi il legame tra i filamenti glicanici è generalmente un legame diretto 3-4, che si forma tra il gruppo aminico del diaminoacido in posizione 3 di un tetrapeptide e il gruppo carbossilico della D-alanina in posizione 4 del tretrapeptide adiacente. Il legame 3-4 avviene ad opera delle D,D transpeptidasi PBP. Un altro tipo di legame crociato presente nel PG è quello tipo 3-3 che si forma tra il gruppo aminico del diaminoacido in posizione 3 ed il gruppo carbossilico del diaminoacido presente nel tetrapeptide del filamento glicanico adiacente ed è catalizzato da L,D-transpeptidasi . In E. coli, sono noti cinque enzimi con attività L,D-transpeptidasica, di cui tre (LdtA, LdtB, LdtC) ancorano la lipoproteina più abbondante della OM (lipoproteina di Braun) al PG e due (LdtD, LdtE) catalizzano il legame crociato 3-3. La delezione di tutti questi geni, singolarmente o in combinazione, non presenta nessun fenotipo, suggerendo che in condizioni normali questo legame è dispensabile. Per studiare la correlazione tra il legame crociato 3-3 e il blocco del trasporto del LPS abbiamo creato mutanti arabinosio dipendenti per alcuni dei componenti del sistema Lpt deleti contemporaneamente per i geni che esprimono le L,D-transpeptidasi LdtD e LdtE. In precedenza, nel nostro laboratorio è stato dimostrato che la deplezione di uno qualsiasi dei geni lpt causa la formazione di cellule filamentose e l’arresto della crescita ma non la lisi cellulare. Invece, nei mutanti ΔldtDΔldtE, in deplezione dei geni lpt, oltre alla formazione di cellule filamentose si osserva la formazione di un setto anomalo e la lisi cellulare. Questi dati suggeriscono che il rimodellamento del peptidoglicano a seguito della formazione di legami 3-3 potrebbe essere una forma di riposta al danno alla membrana esterna.