An evaluation of an innovative technological platform for straightforward purification of recombinant proteins

In questo lavoro di tesi si valuta l'applicazione di un metodo di purificazione di proteine ricombinanti basato sulla combinazione di due diverse specie biochimiche: inteine e polipeptidi elastino-simili. Le inteine sono una classe di proteine che operano una auto-eliminazione dalla sequenza in cui sono contenute unendo con legame peptidico le due sequenze precedente e successiva all'inteina stessa. Tale attività (detta di splicing) può essere modulata con delle mutazioni puntuali agli amminoacidi direttamente coinvolti nel meccanismo. I polipeptidi elastino-simili (ELP) ricalcano l'estesa ripetizione del motivo pentapeptidico tipico dell'elastina bovina. I polipeptidi ELP sono una famiglia di biopolimeri formata dal ripetersi dell'unità pentapeptidica “Val-Pro-Gly-Xaa-Gly”, dove Xaa può essere qualsiasi amminoacido. Tali strutture artificiali presentano interessanti qualità tra le quali la capacità di auto-assemblaggio (aggregazione reversibile) in seguito a variazione di parametri chimico-fisici quali temperatura, pH e forza ionica. I peptidi elastino-simili sono solubili in acqua se si trovano al di sotto di una caratteristica temperatura di transizione inversa (Tt) tipica della loro struttura, ma subiscono una transizione di fase causata dalla formazione di aggregati insolubili, quando la temperatura dell'ambiente supera la Tt. Questo peculiare comportamento dei polipeptidi ELP viene preservato anche quando sono fusi ad un'altra struttura proteica, pertanto queste strutture generate dalla fusione tra ELP e una proteina ricombinante rappresentano una nuova generazione di proteine “intelligenti”, le cui proprietà chimico-fisiche e funzionali possono essere modulate in funzione delle caratteristiche ambientali. Oltre alla temperatura e alla forza ionica, altre variabili ambientali che possono influenzare la transizione di fase dei polipeptidi ELP e delle corrispondenti fusioni ELP-proteina, sono il pH, l'aggiunta di soluti organici e solventi, la concentrazione proteica. 132 Nella tecnica descritta in questo lavoro, la transizione di fase degli ELP viene quindi sfruttata in un ciclo di transizione inversa (ITC): il tampone in cui si trova il costrutto di fusione viene modificato (per aggiunta di cloruro di sodio) per far precipitare e risolubilizzare la proteina. In tal modo si permette l'eliminazione dal campione dei contaminanti solubili (quando la proteina è precipitata) e insolubili (quando è in soluzione). Dopo due ITC il costrutto è sufficientemente puro da poter operare un'auto-digestione attraverso l'attività dell'inteina. Per operare la digestione è sufficiente l'agguinta di un composto tiolico (es. DTT) in basse concentrazioni a temperatura ambiente. La reazione di digestione necessita di 20 ore per arrivare a completezza.