Molecular genetics of familial tubulopathiens: claudin -16 and claudin-19 mutations in familal hypomagnesemia, hypercalciuria and nephrocalcinosis

L’ipomagnesemia, ipercalciuria e nefrocalcinosi familiare (FHHNC; OMIM 248250) è una tubulopatia renale rara a trasmissione autosomica recessiva, caratterizzata da perdita della funzione di riassorbimento del magnesio, ipercalciuria, nefrocalcinosi, formazione di calcoli renali, ricorrenti infezioni renali e progressiva insufficienza renale (i pazienti sono candidati a trapianto renale). I pazienti sono anche soggetti a spasmi muscolari, convulsioni e anomalie oculari. Sono inoltre stati osservati alti livelli dell’ormone paratiroideo (PTH) nel corso della malattia. Fino ad oggi la FHHNC è stata diagnosticata in circa 200 individui sparsi in tutto il mondo. Nelle famiglie FHHNC finora indagate la sindrome cosegrega con mutazioni nei geni CLDN16 e CLDN19. Questi due geni codificano per due proteine appartenenti alla famiglia delle claudine, le claudine 16 e 19, espresse nelle tight junctions nel tratto ascendente spesso dell’ansa di Henle. Attualmente si hanno poche informazioni sulla struttura e funzione di queste due proteine. È stato però ipotizzato che, interagendo tra loro, formerebbero dei pori attraverso cui passerebbe il magnesio secondo gradiente elettrochiminco. Lo scopo principale di questo studio è stato quello di (1) espandere lo spettro delle mutazioni nei geni CLDN16 e CLDN19 nelle famiglie FHHNC e indagare la loro distribuzione all’interno di popolazioni differenti e diverse aree geografiche, (2) cercare di stabilire una correlazione genotipo-fenotipo nei pazienti affetti dalla patologia e contribuire all’analisi della relazione struttura-funzione delle claudine 16 e 19, (3) identificare altri eventuali geni coinvolti nell’insorgenza della FHHNC, (4) e, poiché recenti studi hanno associato la sovraespressione di CLDN16 con una diminuzione dell’aggressività del carcinoma al seno, indagare se le mutazioni in CLDN16 identificate come causa dell’insorgenza della FHHNC possano influire sulle eventuali capacità antitumorali della proteina. Lo studio presentato in questa tesi di dottorato è stato condotto su 27 famiglie FHHNC non consanguinee, per un totale di 33 pazienti sottoposti ad analisi genetica. Per ciascuno di questi pazienti e per alcuni parenti sani abbiamo raccolto campioni di sangue dai quali sono stati estratti DNA, RNA totale e proteine. Per ciascuno dei 33 pazienti FHHNC l’analisi genetica è iniziata con il sequenziamento diretto dell’intera regione codificante e dei siti di regolazione dello splicing del gene CLDN16. In 12 pazienti abbiamo identificato complessivamente tre nuove mutazioni non senso (R214X, W217X, Y213X), quattro nuove variazioni presumibilmente associabili all’insorgenza della malattia (L116F, C120Y, G239V, E294K) e cinque mutazioni già precedentemente descritte (S110R, N123fs, L145P, R149X, L151F). Per i 21 pazienti FHHNC, risultati negativi per mutazioni nel gene CLDN16, la caratterizzazione molecolare è proseguita con l’analisi della sequenza codificante e dei siti di regolazione dello splicing del gene CLDN19. In 12 pazienti abbiamo identificato complessivamente una mutazione già descritta in precedenza (G20D) e una delezione che interessa gli esoni 1-4 del gene (è il primo caso noto di delezione quasi totale del gene CLDN19). Risultano tuttora in corso la caratterizzazione molecolare di 9 pazienti per i quali non sono state identificate mutazioni associabili all’insorgenza della malattia nei geni CLDN16 e CLDN19 e le analisi per valutare se mutazioni che comportano una completa o parziale scomparsa della funzione di claudina-16 nel rene possano causare anche diminuzione o scomparsa della sua ipotetica capacità antitumorale nelle cellule di tumori del seno. I risultati di questo lavoro espandono lo spettro delle mutazioni patogenetiche di CLDN16 e CLDN19 nei pazienti FHHNC, contribuendo a fornire informazioni relative alla patogenesi della sindrome e allo studio della relazione struttura-funzione nelle claudine 16 e 19. Saranno tuttavia necessari ulteriori approfondimenti sperimentali per comprendere meglio l’effetto di ciascuna mutazione sulla funzionalità delle due proteine.