Fostering Cell Transformation Assay in carcinogenicity assessment: toward in vitro-in silico bridging

The evaluation of the carcinogenic potential to humans relies at regulatory level on the two-year rodent bioassays (OECD TG451), which are extremely costly in terms of time and animals used, and whose predictive value towards humans has been questioned. The Cell Transformation Assays (CTAs) are the most advanced in vitro methods to identify the chemical carcinogenicity potential, in terms of standardization and validation, and reproduce key stages of in vivo transformation. The endpoint is the formation of transformed colonies (or foci) upon treatment with a carcinogen, which are visually scored by stereomicroscopy, using defined morphological features. These assays offer several advantages in comparison to the in vivo bioassays in rodents, and are used by industry and academia as screening methods for carcinogenicity testing and as a tool for mechanistic studies. Even though OECD Guidance Documents on CTAs have been recently published, further improvements are considered important to enhance the use of the assay. We developed two approaches aiming to: i) increase throughput and reliability of the scoring process, by developing algorithms and statistical methods designed to quantitatively characterize foci morphological features and ii) increase the understanding of in vitro transformation mechanisms, through the molecular characterization of transformed cells from foci, and from initial phases of transformation. A database of digital images of foci from CTAs performed by EURL ECVAM (JRC), in the prevalidation study, and by ARPA-ER, were acquired and foci regions were isolated from the background through an originally developed algorithm. Statistical image descriptors defining the morphological features recognized during visual scoring were developed to cover size, multilayer growth, spindle-shape, invasiveness, and degree of heterogeneity of foci. Statistical models were developed to automatically classify foci, supporting the phase of visual scoring. In addition, exploiting fitted parametric models using defined statistical descriptors, it was possible to estimate the effects of concentrations of tested carcinogens on foci morphologies. To disclose the mechanisms of in vitro transformation, it is crucial to evaluate the process through a temporal approach. Cells from initial phases of exposure to carcinogen and from transformed foci were collected to perform transcriptomic and biochemical analyses of signalling cascades. We exploited this system to study mechanisms involved in cadmium-induced transformation, hence cadmium is an established human carcinogen, but whose mechanisms of action are still not fully understood. During in vitro transformation many processes are involved and non-unique ways to the establishment of transformed cells can be covered. Indeed, we demonstrated that upon the same stimulus, foci characterised by different phenotypes can be induced, and different phenotypes correspond indeed to a specific biochemical/molecular cell clone fingerprint. This approach provides a tool for mechanistic studies and it will allow the comprehension of the links between transformed phenotype of foci and the biochemical fingerprint. An increased mechanistic understanding of in vitro transformation could support an integrated approach based on quantitative scoring of foci and molecular fingerprinting. This advancement will also meet specific recommendations of EURL ECVAM in view of future broader acceptance of these assays.

La valutazione del potenziale carcinogeno delle sostanze chimiche si basa, a livello regolatorio, sul saggio di cancerogenesi sui roditori (OECD, TG 451). La loro diffusa applicabilità è però messa in discussione a causa delle lunghe tempistiche e dei costi associati alla loro esecuzione, e dal potenzialmente limitato valore predittivo verso l'uomo. I Cell Transformation Assays (CTA) sono tra i metodi in vitro più avanzati e standardizzati a livello regolatorio. I CTA riproducono passaggi chiave della trasformazione in vivo; si basano sulla formazione, in seguito al trattamento con un sospetto carcinogeno, di colonie trasformate (o foci), classificate al microscopio da un esperto sulla base di caratteristiche morfologiche standard. I CTA sono impiegati sia per la valutazione del rischio sia nell'ambito della ricerca; tuttavia, per consentirne un maggior utilizzo, alcuni miglioramenti sono auspicabili. Nel presente lavoro sono stati sviluppati due approcci allo scopo di potenziare i saggi CTA. Il primo ha lo scopo di ottimizzare la fase di riconoscimento dei foci trasformati sulla base di caratteristiche morfologiche, spesso affetta da soggettività. Questo obiettivo è stato raggiunto sviluppando algoritmi e metodi statistici per definire in modo quantitativo le caratteristiche morfologiche dei foci. Il secondo approccio ha come obiettivo il miglioramento della comprensione dei meccanismi coinvolti nella trasformazione in vitro, attraverso la caratterizzazione biochimica e molecolare di cellule isolate da foci e durante fasi iniziali della trasformazione. E' stato acquisito un database di immagini di foci ottenuti tramite saggi CTA condotti da EURL ECVAM (JRC), nell'ambito dello studio di prevalidazione, e da ARPA-ER. Sono stati sviluppati: 1) un algoritmo di segmentazione capace di isolare la regione del focus dal monostrato circostante; 2) descrittori statistici delle immagini dei foci, allo scopo di riassumere le caratteristiche di dimensione, crescita multistrato, invasività e grado di eterogeneità dei foci, e spindle-shape delle cellule. I descrittori statistici così definiti sono stati impiegati per costruire modelli di classificazione dei foci, allo scopo di fornire supporto alla classificazione operata dall'esperto. Inoltre è stato possibile studiare l’effetto esercitato dalla concentrazione di due carcinogeni sulla morfologia dei foci trasformati, come catturata dai descrittori statistici introdotti. Allo scopo di migliorare la comprensione dei meccanismi di cancerogenesi in vitro, sono state valutate diverse fasi temporali del processo. Campioni provenienti dalle fasi iniziali del processo di trasformazione e da foci trasformati sono stati analizzati tramite tecniche di biochimica e trascrittomica. Il saggio CTA è un metodo utilizzato ampiamente in accademia per studiare i meccanismi di azione della cancerogenesi chimica; abbiamo sfruttato questa configurazione sperimentale per analizzare i processi coinvolti nella cancerogenesi in vitro indotta da cadmio, cancerogeno umano i cui meccanismi di azione sono ancora non completamente noti. Abbiamo dimostrato che nelle fasi iniziali a seguito di trattamento con cadmio sono coinvolti processi riguardanti l'omeostasi degli ioni Cd2+, Zn2+ e Ca2+, alterazioni del citoscheletro e della segnalazione cellulare. A partire da questi processi di difesa, possono essere intraprese vie non univoche per completare la trasformazione: a fronte dello stesso stimolo possono originarsi foci caratterizzati da diversi fenotipi, che sottendono a diversi profili biochimici/molecolari. L'inclusione nei saggi CTA di una valutazione oggettiva delle caratteristiche morfologiche e della corrispondenza tra il fenotipo dei foci trasformati e le caratteristiche molecolari alla base del processo di trasformazione, rappresenta un significativo avanzamento nella valutazione della cancerogenesi in vitro, componente di un più generale approccio integrato alla valutazione del rischio.