Assessment of Microbial Degradative Functions for the Evaluation of the Environmental Quality of Hydrocarbon Contaminated Soils

The project deals with the problem of soil contamination due to human activities. Under stress conditions caused by contamination, the development and biochemical activities of soil microorganisms undergo several alterations. Therefore, microbiologically-related parameters should be involved in the assessment of soil quality. As there are some difficulties in enriching and isolating microorganisms from soil, cultivation-independent molecular approaches have been developed. The aim of this project was to obtain molecular tools to use as "marker" sequences for the evaluation of the environmental quality of contaminated soils. The identified degradative capabilities were used to evaluate the potential of the depuration of an hydrocarbon contaminated soil using a culture-independent approach. The project can be divided into three main steps: 1. the isolation of interesting bacteria belonging to Rhodococcus genus and sequencing of the whole-genome. Characterization of novel metabolic potentials of hydrocarbon-degradative bacteria belonging to Rhodococcus genus using Phenotype Microarray analysis; 2. genome analysis to identify different genes and metabolic pathways involved in the degradation of different hydrocarbons to use as "marker" sequences; 3. assessment of contaminated soil based on the catabolic functions identified in microcosms experiments. R. opacus R7 is a Gram-positive bacterium isolated from a polycyclic aromatic hydrocarbon contaminated soil for its ability to grow on naphthalene and o-xylene. The metabolic abilities of this strain were investigated more widely in presence of different carbon sources and different xenobiotic compounds using the Phenotype Microarray (Biolog) analysis. To thoroughly investigate the sequences involved in hydrocarbons degradation, the whole-genome sequence of R7 was compared to reference strains, such as Rhodococcus sp. BCP1 and R. jostii RHA1, using different bioinformatics tools and literature retrievals. Several gene clusters involved in hydrocarbon metabolism were identified: alk, prm, akb, dsz, nar, gen bph, naphthenic acids clusters and cat, pca, paa, hmg clusters involved in peripheral metabolisms. Solid-phase microcosm experiments were performed to assess the potential of depuration of an hydrocarbon contaminated soil. The soil was characterized considering agronomic, chemical and microbiological parameters. The chemical analyses showed the absence of o-xylene. Therefore, it was contaminated with an o-xylene solution using a newly developed spiking method. According to the experimental plan, different solid-phase microcosms were set up. The biodegradation kinetics and the marker sequences involved in this metabolism were monitored. The results showed that the o-xylene biodegradation activity derived from both autochthonous bacteria and R7 strain. The depuration potential of the soil was assessed using marker sequences such as prm and akb genes.

La contaminazione dei suoli è uno dei fenomeni più preoccupanti degli ultimi decenni a causa del moltiplicarsi di situazioni di forte inquinamento ambientale da parte di attività antropiche. I parametri microbiologici dovrebbero essere considerati nella valutazione della qualità del suolo. Per aggirare alcune difficoltà nell’isolamento dei microrganismi, sono stati sviluppati approcci molecolari di coltivazione indipendente. In questa prospettiva, lo scopo è quello di ottenere “tools” molecolari dallo studio di vie metaboliche microbiche coinvolte nella degradazione dei contaminanti più diffusi nell'ambiente al fine di identificare sequenze marker per valutare la funzionalità di diversi suoli contaminati da idrocarburi. Questo progetto può essere declinato in tre fasi principali: 1. isolamento di microrganismi con potenziali capacità degradative e il sequenziamento dei loro genomi; 2. analisi dei genomi e caratterizzazione dei pathway metabolici e dei geni catabolici coinvolti nella degradazione di composti idrocarburici al fine di individuare sequenze marker; 3. analisi di suoli utilizzando le funzioni metaboliche individuate per valutare la loro capacità autodepurativa. Tra i batteri che occupano un ruolo principale nella degradazione dei contaminanti del suolo si ritrovano i microrganismi appartenenti al genere Rhodococcus. I rhodococci sono batteri aerobi Gram-positivi, metabolicamente versatili e frequentemente presenti nell'ambiente. Da studi precedenti il ceppo di R. opacus R7 è stato isolato da un suolo contaminato da idrocarburi policiclici aromatici e caratterizzato per la sua capacità di crescere in presenza di naftalene, o-xilene e diversi n-alcani. Al fine di investigare ulteriormente le sue potenzialità metaboliche è stato condotto uno screening fenotipico mediante test di crescita con la tecnologia del Phenotype Microarray basata sull’utilizzo di un colorante (tetrazolium violet) come marcatore di metabolismo attivo: in presenza di metabolismo attivo il colorante diventa viola con una reazione irreversibile. Gli esperimenti di screening fenotipico sono stati condotti su 41 diversi composti idrocarburici. Al fine di individuare le sequenze coinvolte in questi metabolismi, le sequenze genomiche del ceppo di R7 sono state comparate con quelle di ceppi di riferimento, come Rhodococcus sp. BCP1 e R. jostii RHA1 mediante tools bioinformatici e informazioni derivanti dalla letteratura. Sono stati identificati diversi cluster genici coinvolti nel metabolismo di composti idrocarburici: alk, prm, akb, dsz, nar, gen bph, acidi naftenici e cat, pca, paa, hmg, cluster genici coinvolti nel metabolismo periferico. Al fine di analizzare campioni di suolo contaminato utilizzando le funzioni metaboliche individuate, sono stati allestiti esperimenti in microcosmo. È stato utilizzato un suolo proveniente da una zona agricola che è stato caratterizzato valutando parametri pedologici, chimici e microbiologici. Le analisi chimiche hanno evidenziato l’assenza di o-xilene. Per questo, mediante un nuovo metodo di contaminazione, il suolo è stato contaminato con o-xilene e secondo un piano sperimentale, sono stati allestiti diversi microcosmi in fase solida. Sono state condotte cinetiche di biodegradazione in diverse condizioni e sono state monitorate le funzioni metaboliche presenti attraverso l’utilizzo di sequenze geniche coinvolte. I risultati hanno mostrato che la degradazione osservata nei microcosmi addizionati del ceppo R7 era pari a quella nei microcosmi dove era presente solo la flora batterica autoctona. Inoltre il potenziale autodepurativo del suolo è stato valutato mediante l’utilizzo di sequenze marker appartenenti ai cluster prm e akb che si sono rivelati coinvolti nel metabolismo di composti appartenenti al gruppo dei BTEX, in particolare dell’o-xilene.