Sviluppo di sistemi terapeutici nanoparticellari a base di nuovi derivati dell’acido polilattico finalizzati al trattamento di patologie ossee

Il polilattide (PLA) e il suo co-polimero con l’acido glicolico (PLGA) appartengono alla famiglia dei poli-esteri alifatici, polimeri di sintesi frequentemente utilizzati in ambito farmaceutico per la loro biocompatibilità e scarsa citotossicità, approvati FDA per la somministrazione parenterale. Esistono però alcune limitazioni nell’uso del PLA e derivati nella realizzazione di sistemi di rilascio controllato dei farmaci, come nanoparticelle (NP). In particolare, il PLA è caratterizzato da un’elevata idrofobicità e da un elevato grado di cristallinità che rendono il profilo di degradazione della matrice polimerica piuttosto lento e, di conseguenza, anche la cessione dell’attivo in essi incapsulato. Per queste ragioni è necessario realizzare derivati del PLA per renderlo più adatto all’applicazione farmaceutica. Inoltre, in relazione alla patologia di interesse, è auspicabile che le NP possano essere indirizzate in maniera selettiva alla cellula bersaglio, esponendo sulla superficie delle NP di un agente di targeting attivo. Il progetto di ricerca della dottoranda è stato finalizzato alla realizzazione di NP per il trattamento di diverse patologie ossee ed è stato organizzato in due filoni: nel primo, la dottoranda ha studiato l’impiego di derivati del PLA ottenuti dalla funzionalizzazione con residui gommosi, scelti come probabile alternativa ai derivati PEGilati di uso comune, per la realizzazione di sistemi nanoparticellari, mentre nella seconda parte della ricerca la dottoranda si è focalizzata sulla realizzazione di smart nanoparticles a partire da PLGA derivatizzato con agenti di targeting attivo. Nel primo caso il polimero selezionato è il PCNL, polimero sintetizzato nel laboratorio del prof. Hillmyer dell’Università del Minnesota: la presenza di una porzione gommosa dovrebbe rendere più veloce il profilo di degradazione delle NP. Innanzitutto, la dottoranda ha valutato la citocompatibilità del nuovo polimero che ha manifestato una scarsa tossicità e quindi il polimero si presenta come buon candidato per la realizzazione di sistemi nanoparticellari. Successivamente, il polimero è stato utilizzato per la realizzazione di NP. Il metodo utilizzato e le condizioni di processo sono state ottimizzate utilizzando un PLA di peso molecolare paragonabile al PLA utilizzato per la sintesi del PCNL. Nonostante gli sforzi per individuare una metodica opportuna, le NP ottenute con PCNL mediante la tecnica della nanoprecipitazione non hanno dimostrato le caratteristiche dimensionali desiderate, probabilmente a causa del peso molecolare e della Tg del residuo gommoso. Per cui il polimero è stato momentaneamente accantonato. Per quanto riguarda la seconda parte della ricerca sono state realizzate NP intelligenti a base di PLGA funzionalizzato con un piccolo peptide che riconosce in maniera selettiva il recettore EGFR. L’obiettivo della dottoranda è stato quello di realizzare sistemi terapeutici destinati al trattamento di patologie dell’osso caratterizzate da una sovraespressione del EGFR, cioè tumori e artrite reumatoide. Il ligando selezionato come oggetto della ricerca è il GE11, dodecapeptide che funge da ligando allosterico del recettore EGFR. Nello specifico, questo filone del lavoro di ricerca è stato diviso in due parti, una parte chimica di sintesi e una parte di realizzazione dei sistemi nanoparticellari. La prima parte del lavoro è stata condotta presso il dipartimento di Chimica dell’Università di Milano, nel laboratorio della prof.ssa Speranza, dove la dottoranda si è concentrata sulla sintesi del peptide GE11 e del coniugato GE11-PLGA. Il peptide è stato sintetizzato con la tecnica della sintesi in fase solida, con una resa di processo del 45% e una purezza del peptide >95%. Successivamente, il GE11 è stato legato covalentemente al PLGA mediante la chimica della carbodiimmide. Il processo ha avuto una resa del 50-60%; dall’analisi NMR si può ricavare un’efficienza di funzionalizzazione del polimero pari al 70-80%. Nella seconda parte del lavoro, la dottoranda si è occupata della realizzazione di sistemi nanoparticellari: la metodica di preparazione è stata ottimizzata inizialmente con i polimeri puri, PLGA ed un suo derivato coniugato al polietilenglicole (PEG-PLGA), al fine di settare le condizioni di processo migliori ad ottenere NP con le dimensioni adatte ad una somministrazione sistemica e locale. Prima di passare alla realizzazione delle NP con il coniugato GE11-PLGA, sono state realizzate NP modello: infatti in questa fase è stato utilizzato un tetrapeptide modello (FQPV) per indagare le criticità della sintesi di smart nanoparticles, per poi utilizzare il coniugato di interesse GE11-PLGA in una fase successiva. Il coniugato FQPV-PLGA è stato ottenuto con la stessa metodica del coniugato GE11-PLGA. Le NP con il coniugato FQPV-PLGA sono state realizzate secondo due metodiche differenti: la nanoprecipitazione, utilizzando DMSO come solvente, e una metodica “ibrida”, utilizzando una miscela 80:20 acetone-CH2Cl2, come selezionato mediante disegno sperimentale (DoE). Le NP hanno mostrato dimensioni intorno ai 200 nm con entrambe le metodiche. Inoltre, sono state sviluppate altre due strategie complementari a quelle descritte, al fine di aumentare l’entità di caricamento del peptide FQPV nelle NP di PLGA. A questo scopo, sono stati realizzati lotti in cui il peptide FQPV è stato adsorbito sulle NP di PLGA: con questa metodica è stato ottenuto un buon caricamento (1:29.9 FQPV:PLGA p:p) che però si è dimostrato instabile nel tempo. La seconda metodica ha previsto l’incapsulazione del peptide FQPV ma i risultati non sono stati ottimali: il metodo ha permesso una scarsa incapsulazione del peptide (1:150 FQPV:PLGA p:p). Per la realizzazione delle NP di GE11-PLGA solo la metodica della nanoprecipitazione utilizzando il DMSO come solvente è stata utilizzata, a causa della insolubilità del coniugato negli altri solventi comunemente utilizzati (acetone, diclorometano). Le formulazioni considerate e caratterizzate sono due: una in cui la matrice delle nanoparticelle è formata solo dal coniugato GE11-PLGA e la seconda in cui il coniugato è in miscela 1:1 p:p con un PEG-PLGA di uguale peso molecolare. Entrambe le formulazioni realizzate presentano una dimensione intorno a 140 nm e un potenziale zeta negativo (-20 mV). Di entrambe le formulazioni è stata valutata anche la citotossicità mediante MTS test su cellule caratterizzate da una sovraespressione del EGFR (A549, carcinoma polmonare, e Caki1, carcinoma renale): entrambe hanno dimostrato un’ottima citocompatibilità sulle linee cellulari selezionate in un ampio range di concentrazioni (0,1µg/ml to 1mg/ml). Le NP sono state caratterizzate mediante DSC per valutarne il comportamento termico rispetto al polimero puro. Le NP di GE11-PLGA hanno manifestato una Tg intorno a 50°C, del tutto paragonabile al comportamento del coniugato (49,33°C). Invece, le NP di GE11-PLGA/PEG-PLGA hanno una Tg a 21°C, dovuta al contributo del coniugato e del polimero PEGilato che invece ha una Tg sub-ambiente. Questo comportamento potrebbe influenzare la cinetica di rilascio del farmaco veicolato. Tutti i sistemi nanoparticellari realizzati hanno un’ottima stabilità a 4°C in acqua per 30 giorni, a simulare una possibile forma di stoccaggio prima della somministrazione al paziente. Il test di stabilità a 37°C a pH 5 e pH 7,4, per simulare un’infiammazione e il pH fisiologico, invece ha evidenziato una tendenza all’aggregazione delle NP dopo 15-20 giorni in entrambe le condizioni di pH, come se la presenza del peptide creasse instabilità alle NP. Successivamente, la dottoranda ha valutato la stabilità delle NP nei fluidi biologici, in particolare in plasma umano e in liquido sinoviale umano. Questa parte del lavoro è stata condotta presso il gruppo del prof. Braeckmans dell’Università di Gent (BE). Gli esperimenti sono stati condotti con fSPT (fluorescence Single Particle Tracking) su NP di GE11-PLGA/ PEG-PLGA marcate con RhB. Da questi test si osserva che le NP sono stabili in entrambi i mezzi considerati: solamente in plasma umano si osserva un aumento della dimensione dovuto alla formazione di una corona proteica attorno alle NP. Le dimensioni restano comunque entro valori accettabili per la loro applicazione in vivo. Sempre durante il periodo di ricerca all’estero, la dottoranda si è occupata degli studi di uptake al fine di valutare il profilo di captazione delle NP in cellule caratterizzate da una sovraespressione del EGFR nel tempo. Il test è stato condotto con microscopia confocale, andando a quantificare la fluorescenza delle NP marcate con RhB all’intero delle cellule. Il test ha dimostrato una internalizzazione attiva delle NP con il coniugato GE11-PLGA che è risultata veloce e prolungata nel tempo, visto che dopo 24 ore le NP erano ancora presenti all’interno delle cellule. Anche le NP di solo PLGA, utilizzate come controllo, sono captate dalle cellule con un meccanismo attivo anche se il profilo è differente rispetto alle NP con il peptide GE11: l’uptake è più lento e dopo 24 ore le NP non sono più all’interno delle cellule. Le NP selezionate sono state quindi caricate con Desametasone, farmaco utilizzato per il trattamento di numerose patologie reumatiche. Diverse strategie sono state considerate al fine di aumentare il grado di incapsulazione; i risultati migliori sono stati ottenuti utilizzando Etilacetato come solvente insieme al DMSO (300 µg/100 mg polimero). I risultati raccolti relativi alle nanoparticelle di GE11-PLGA sono promettenti, se si pensa alla mancanza di aggregazione nei fluidi biologici e alla buona captazione all’interno delle cellule che sovraesprimono EGFR. Sono in corso studi mirati allo studio dei meccanismi di uptake cellulare e trafficking intracellulare delle NP e alla valutazione dell’uso di uno spaziatore tra PLGA e GE11, alternativo al PEG, al fine di migliorare l’esposizione superficiale del peptide.