Studio e caratterizzazione delle isoforme della tirosino chinasi non recettoriale ARG nel differenziamento neuronale in vitro

Il gene umano ARG (o ABL2) codifica per una proteina che appartiene alla sottofamiglia Abelson delle tirosino chinasi non recettoriali (Kruh et al.,1990; Perego et al., 1991). Arg in vitrù dei domini di legame alle proteine del citoscheltro (Hernandez et al., 2004a e Miller et al., 2004) e al coinvolgimento, mediante la sua attività chinasica, nei pathway molecolari di riarrangiamento del citoscheletro (Galkin et al., 2005) è attivamente coinvolto nel processo di neuritogenesi e di formazione e funzione delle sinapsi (Koleske et al., 1998). Come per c-Abl anche per Arg sono state descritte, per splicing alternativo dell’esone 1, due isoforme N-terminali (1A e 1B) (Kruh et al., 1990). Nel nostro laboratorio sono state identificate con metodiche di RT-PCR qualitativa nuovi trascritti di Arg che predicono isoforme con diverse estremità 5' e 3' (Perego et al., 2005). Per quanto riguarda le estremità 5' si è dimostrato che l’escissione alternativa dell’esone 2, giustapposto all’esone 1A o 1B, produce quattro diversi trascritti definiti B-Long (BL), B-Short (BS), A-Long (AL) e A-Short (AS) (Perego et al., 2005). Le forme "Long" mantengono l’esone 2 costituito da 63 paia di basi e lo splicing alternativo di questo esone non interrompe l’open reading frame della proteina. All’estremità 3' sono state invece identificate 2 ulteriori isoforme che differiscono per una sequenza, detta ΔCT, di 309 paia di basi corrispondenti a 103 amminoacidi e che sono state definite come "Short" e "Long" (CTS e CTL) a seconda che abbiano perso o meno questa sequenza; la delezione della sequenza ΔCT elimina parte del primo sito legante l’actina (Perego et al., 2005). I trascritti corrispondenti alle diverse estremità 5' e 3' sono differentemente espressi nei vari tipi cellulari e durante la differenziazione mieloide e linfoide (Perego et al., 2005). Combinando i diversi splicing dell’estremità 5' e 3' è possibilie ipotizzare l’esistenza di otto diverse isoforme full-length di Arg (ASCTS, ALCTS, ASCTL, ALCTL, BSCTS, BLCTS, BSCTL e BLCTL), dotate di diversa possibilità di interazione con il citoscheletro e differente coinvolgimento in pathways metabolici. Per dimostrare l’effettiva espressione endogena dei trascritti corrispondenti alle otto diverse isoforrme full-ength di Arg abbiamo prima analizzato, mediante Real-Time PCR, il pattern d’espressione delle diverse estremità 5' e 3' del trascritto di Arg nelle linee cellulari renali Hek 293T e Caki-1. Abbiamo così evidenziato che le estremità 5' sono tutte espresse solo nelle cellule Caki-1, a differenza delle cellule Hek 293T, che esprimono solo le forme B. Le estremità 3' invece sono espresse, anche se con rapporti quantitativi differenti, in entrambe le linee. La linea cellulare Caki-1 è stata quindi utilizzata per dimostrare l’effettiva espressione dei trascritti corrispondenti alle 8 diverse isoforme di Arg mediante cicli sequenziali di PCR (Long e Nested PCR) che utilizzavano combinazioni di diversi primers specifici. La presenza di amplificati della dimensione attesa per le diverse isoforme full-length dimostra, in queste linea cellulare, l’effettiva espressione di tutti 8 i trascritti full-length di Arg predetti. Una volta dimostrata l’esistenza delle otto isoforme di Arg abbiamo cercato di valutarne il coinvolgimento in un modello di differenziamento neuronale "in vitro", basandoci sui dati di letteratura che vedono Arg coinvolto nella neuritogenesi e nella formazione e funzione delle sinapsi (Koleske et al., 1998). Pertanto la linea cellulare di neuroblastoma umano SH-SY5Y è stata indotta al differenziamento per trattamento con ATRA (All-Trans-Retinoic-Acid) e Abeta (peptide amiloidogeno (Aβ1-42)), che come documentato in letteratura è dotata a basse concentrazioni di attività neurotrofica (Susen and Blochl, 2005). L’effetto differenziativo prodotto sulla linea cellulare SH-SY5Y da questi trattamenti è stato documentato mediante analisi morfologica e in immunofluorescenza, mentre tramite Real-Time PCR e western blot si sono quantificati i livelli del trascritto e della proteina di Arg prima e dopo trattamento ed analizzati i livelli di espressione relativa dei trascritti corrispondenti alle diverse estremità 5' e 3', allo scopo di evidenziare eventuali variazioni in corso di differenziamento. Inoltre sulla base dei dati di letteratura che evidenziano il ruolo di Arg come promotore della neuritogenesi in cellule di neuroblastoma N2A (Hernandez et al., 2004b) per attivazione dell’inibitore di Rho p190RhoGAP, in seguito a fosforilazione Arg-dipendente della sua tirosina 1105 (Y1105), è stato analizzato il livello di p190RhoGAP fosforilato in Y1105. Nelle cellule SH-SY5Y, trattate con 20μM ATRA per 6 giorni, Arg sembra essere coinvolto in un pathway neurodifferenziativo p190RhoGAP-dipendente, infatti il trascritto totale di Arg incrementa e sebbene il livello proteico di Arg sia paragonabile a quello delle cellule controllo, il livello di p190RhoGAP fosforilato in Y1105 risulta aumentato. Arg sembra essere coinvolto anche nel processo neurodifferenziativo a cui le cellule SH-SY5Y vanno incontro per trattamento con 0,01μM Abeta per 72 ore, infatti l’analisi mediante Real-Time PCR e western blot ha mostrato un’over-espressione sia del trascritto che della proteina totale di Arg nelle cellule SH-SY5Y trattate con Abeta rispetto alle cellule controllo. Inoltre il pattern di espressione delle isoforme di Arg, analizzato tramite Real-Time PCR, ha mostrato una maggiore espressione del trascritto con estremità 3' di tipo CTL rispetto alla controparte CTS, al contrario di quanto succede nelle cellule controllo. L’analisi del livello di p190RhoGAP fosforilato in tirosina 1105 non mostra però nelle cellule trattate con Abeta una variazione rispetto alle cellule controllo. Questi dati fanno ipotizzare un coinvolgimento di Arg in un pathway di neuritogenesi p190RhoGAP-indipendente, diverso quindi da quello attivato dal trattamento con ATRA nelle cellule SH-SY5Y. Del resto è stato anche descritto che in cellule di neuroblastoma N2A la transfezione di Arg può indurre la neuritogenesi senza indurre inibizione di Rho e quindi attraverso un pathway p190RhoGAP-indipendente (Hernandez et al., 2004b). Ulteriori studi sono in corso per valutare il coinvolgimento di Arg in pathway alternativi a quello di Rho nel processo di neuritogenesi indotto da Abeta. Date le sopra citate caratteristiche di Arg e il suo ruolo nel sistema nervoso centrale visto il ruolo di Abl nel taglio proteolitico del precursore della proteina amiloide (APP) (Perkinton et al., 2004) Abbiamo valutato l’espressione di Arg e delle sue isoforme anche in colture primarie di fibroblasti prelevati da pazienti affetti da Alzheimer rispetto ai controlli sani, riscontrando un’over-espressione del trascritto totale di Arg. Questo dato rappresenta il punto di partenza per studi fututri che mirino a definire il possibile coinvolgimento di Arg nel metabolismo della proteina precursore dall’amiloide APP. Ulteriori studi verranno eseguiti utilizzando concentrazioni potenzialmente neurotossiche di Abeta (2,5μM) per stimolare le cellule SH-SY5Y al fine di valutarne l’effetto sull’espressione delle isoforme di Arg e sulla morfologia cellulare. Per valutare se le otto diverse isoforme full-length di Arg possono avere ruoli diversi nel differenziamento neuronale abbiamo anche approntato studi di tipo funzionale. Transfettando nella linea cellulare SH-SY5Y le otto diverse isoforme di Arg clonate nel vettore di espressione pFlagCMV2. Questi esperimenti hanno evidenziato che le isoforme BLCTL e BSCTL inducono nelle cellule transfettate l’acquisizione di una morfologia più rotondeggiante e una significativa diminuzione dello "spreading cellulare" rispetto alle cellule transfettate con il vettore controllo (LAC Z). L’isoforma BLCTS è invece tra le isoforme B quella che induce una maggiore produzione di protrusioni cellulari quando transfettate nella linea SH-SY5Y. In seguito a transfezione con le isoforme A, normalmente non espresse in questo tipo cellulare, ed in particolare con l’isoforma ALCTS, le cellule sviluppano un fenotipo ricco di estroflessioni di diversa lunghezza e spesso filopodiformi. Dato il ruolo di Arg, documentato in letteratura, nel riarrangiamento del citoscheletro (Galkin et al., 2005), abbiamo voluto poi valutare l’effetto sul citoscheletro di actina e tubulina dell’over-espressione delle isoforme BLCTS e ALCTS, che quando over-espresse inducono in modo più evidente la formazione di estroflessioni cellulari. Dall’analisi in immunofluorescenza delle cellule transfettate con le due isoforme BLCTS e ALCTS è emerso che quando nelle cellule SH-SY5Y viene over-espressa l’isoforma BLCTS la distribuzione dell’F-actina e della tubulina è corticale e paragonabile a quella delle cellule non transfettate mentre nelle cellule che over-esprimono l’isoforma ALCTS l’F-actina ha ancora una distribuzione corticale e paragonabile a quella delle cellule non transfettate, mentre la tubulina si accumula nel citoplasma dove colocalizza con Arg, diffondendo anche nel nucleo. Verranno eseguiti ulteriori studi per approfondire l’effetto dell’over-espressione delle singole isoforme, sia tramite trasfezioni stabili che inducibili delle otto isoforme full-length di Arg.