Pediatric skeletal diseases strongly impair the lifespan of young children. Rare and severe monogenic disorders like Autosomal Recessive osteopetrosis (ARO) and Mucopolysaccharidosis type 1 Hurler (MPSIH) are caused by primary and secondary bone defects, respectively. In particular, ARO patients suffer from high bone density and fragility, neurological defects and bone marrow fibrosis leading to increased number of circulating CD34+ cells. The most frequent form of ARO is due to mutations in TCIRG1 gene, that encodes for a proton pump necessary for bone resorptive activity of osteoclasts. MPSIH syndrome is one of the most frequent lysosomal storage disorders, caused by mutations of IDUA gene, that encodes for the alpha-L-iduronidase enzyme. Defective IDUA enzyme causes lysosomal engulfment due to impaired turnover of glycosaminoglycans (GAGs), leading to severe organ dysfunctions and skeletal abnormalities. The pathogenesis of bone defects in MPSIH is still largely debated. Allogeneic haematopoietic stem cells transplantation (HSCT) is the standard approach for ARO and MPSIH patients, but the high incidence of adverse outcomes and the low availability of compatible donors, pave the way for the development of gene therapy (GT) strategies to cure these diseases. In the present thesis we developed a novel GT strategy based on clinically-optimized lentiviral vectors, driving TCIRG1 expression. We tested our GT protocol on the oc/oc mouse model, closely resembling the human disease, with a life expectancy of 2-3 weeks. GT mice reached up to four months of age, showing an amelioration of the bone phenotype and an improved clinical status. In parallel, CD34+ cells isolated from the blood of ARO patients were phenotypically characterized in terms of hematopoietic stem and progenitor cells composition and analysed for transcriptome profile. Moreover, ARO circulating CD34+ were transduced and expanded, applying a protocol that allows stemness maintenance. We performed in vitro assays to evaluate resorption capacity of patient-derived osteoclasts and we evaluated the long-term multilineage repopulating potential of expanded CD34+ cells by primary and secondary transplant into NSG mice. With regard to MPSIH, GT clinical trial is ongoing at SR-Tiget (NCT03488394), ameliorating skeletal defects and rescuing IDUA activity of MPSIH patients. We investigated the functionality of osteoclasts and their role in delivering IDUA enzyme in the bone microenvironment, cross-correcting mesenchymal stromal cells and their progeny after GT. To this end, we differentiated osteoclasts from the blood or bone marrow of MPSIH patients pre- and post-GT, observing that transduced osteoclasts produce supraphysiological levels of IDUA thus modulating osteoblast-osteoclast cross talk. Our results suggest that GT represents a feasible alternative treatment for TCIRG1-dependent ARO and Hurler syndrome.

Le malattie scheletriche pediatriche compromettono fortemente la durata della vita. Disturbi monogenici rari e gravi come l'osteopetrosi autosomica recessiva (ARO) e la mucopolisaccaridosi di tipo 1 Hurler (MPSIH) sono causati rispettivamente da difetti ossei primari e secondari. In particolare, i pazienti con ARO soffrono di elevata densità e fragilità ossea, difetti neurologici e fibrosi del midollo osseo che portano ad un aumento del numero di cellule CD34+ circolanti. La forma più frequente di ARO è dovuta alle mutazioni del gene TCIRG1, che codifica per una pompa protonica necessaria per l'attività di riassorbimento osseo degli osteoclasti. La sindrome MPSIH è uno dei disturbi da accumulo lisosomiale più frequenti, causato da mutazioni del gene IDUA, che codifica per l'enzima alfa-L-iduronidasi. L'enzima IDUA difettoso causa un ingolfamento lisosomiale dovuto al ridotto turnover dei glicosaminoglicani (GAG), portando a gravi disfunzioni degli organi e ad anomalie scheletriche. La patogenesi dei difetti ossei in MPSIH è ancora ampiamente dibattuta. Il trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche (HSCT) è l'approccio standard per i pazienti ARO e MPSIH, ma l'alta incidenza di esiti avversi e la scarsa disponibilità di donatori compatibili, aprono la strada allo sviluppo di strategie di terapia genica (GT) per curare queste malattie. Nella presente tesi abbiamo sviluppato una nuova strategia di GT basata su vettori lentivirali clinicamente ottimizzati esprimenti il gene TCIRG1. Abbiamo testato il nostro protocollo di GT sul modello di topo oc/oc, molto simile alla malattia umana, con un'aspettativa di vita di 2-3 settimane. I topi GT hanno raggiunto fino a quattro mesi di età, mostrando un miglioramento del fenotipo osseo e dello stato clinico generale. In parallelo, le cellule CD34+ isolate dal sangue di pazienti ARO sono state caratterizzate fenotipicamente in termini di composizione di cellule staminali e progenitori ematopoietici e analizzate dal punto di vista del trascrittoma. Inoltre, le cellule CD34+ circolanti di pazienti ARO sono state trasdotte ed espanse, applicando un protocollo che consente il mantenimento della staminalità. Abbiamo inoltre eseguito test in vitro per valutare la capacità di riassorbimento degli osteoclasti derivati dai pazienti ARO e abbiamo valutato il potenziale di ripopolamento multi-lineage a lungo termine delle cellule CD34+ espanse mediante trapianto primario e secondario in topi NSG. Per quanto riguarda MPSIH, la sperimentazione clinica per la GT è in corso presso SR-Tiget (NCT03488394), e ha mostrato miglioramenti nei difetti scheletrici e nell'attività dell’enziama IDUA dei pazienti MPSIH. Abbiamo studiato la funzionalità degli osteoclasti e il loro ruolo nel fornire l'enzima IDUA nel microambiente osseo, correggendo le cellule stromali mesenchimali e la loro progenie dopo la GT. A tal fine, abbiamo differenziato gli osteoclasti dal sangue o dal midollo osseo di pazienti con MPSIH pre e post-GT, osservando che gli osteoclasti trasdotti producono livelli sovrafisiologici di IDUA, creando così un modello per lo studio del cross talk osteoblasto-osteoclasto. I nostri risultati suggeriscono che la GT rappresenta un trattamento alternativo possibile ed efficace per la cura dell’osteopetrosi TCIRG1-dipendente e della sindrome di Hurler.

(2021). Development of novel cell based therapeutic approaches to correct primary and secondary bone defects.. (Tesi di dottorato, Università degli Studi di Milano-Bicocca, 2021).

Development of novel cell based therapeutic approaches to correct primary and secondary bone defects.

PENNA, SARA
2021

Abstract

Pediatric skeletal diseases strongly impair the lifespan of young children. Rare and severe monogenic disorders like Autosomal Recessive osteopetrosis (ARO) and Mucopolysaccharidosis type 1 Hurler (MPSIH) are caused by primary and secondary bone defects, respectively. In particular, ARO patients suffer from high bone density and fragility, neurological defects and bone marrow fibrosis leading to increased number of circulating CD34+ cells. The most frequent form of ARO is due to mutations in TCIRG1 gene, that encodes for a proton pump necessary for bone resorptive activity of osteoclasts. MPSIH syndrome is one of the most frequent lysosomal storage disorders, caused by mutations of IDUA gene, that encodes for the alpha-L-iduronidase enzyme. Defective IDUA enzyme causes lysosomal engulfment due to impaired turnover of glycosaminoglycans (GAGs), leading to severe organ dysfunctions and skeletal abnormalities. The pathogenesis of bone defects in MPSIH is still largely debated. Allogeneic haematopoietic stem cells transplantation (HSCT) is the standard approach for ARO and MPSIH patients, but the high incidence of adverse outcomes and the low availability of compatible donors, pave the way for the development of gene therapy (GT) strategies to cure these diseases. In the present thesis we developed a novel GT strategy based on clinically-optimized lentiviral vectors, driving TCIRG1 expression. We tested our GT protocol on the oc/oc mouse model, closely resembling the human disease, with a life expectancy of 2-3 weeks. GT mice reached up to four months of age, showing an amelioration of the bone phenotype and an improved clinical status. In parallel, CD34+ cells isolated from the blood of ARO patients were phenotypically characterized in terms of hematopoietic stem and progenitor cells composition and analysed for transcriptome profile. Moreover, ARO circulating CD34+ were transduced and expanded, applying a protocol that allows stemness maintenance. We performed in vitro assays to evaluate resorption capacity of patient-derived osteoclasts and we evaluated the long-term multilineage repopulating potential of expanded CD34+ cells by primary and secondary transplant into NSG mice. With regard to MPSIH, GT clinical trial is ongoing at SR-Tiget (NCT03488394), ameliorating skeletal defects and rescuing IDUA activity of MPSIH patients. We investigated the functionality of osteoclasts and their role in delivering IDUA enzyme in the bone microenvironment, cross-correcting mesenchymal stromal cells and their progeny after GT. To this end, we differentiated osteoclasts from the blood or bone marrow of MPSIH patients pre- and post-GT, observing that transduced osteoclasts produce supraphysiological levels of IDUA thus modulating osteoblast-osteoclast cross talk. Our results suggest that GT represents a feasible alternative treatment for TCIRG1-dependent ARO and Hurler syndrome.
SERAFINI, MARTA
VILLA, ANNA
Osteopetrosi; Sindrome di Hurler; Terapia Genica; Osteoclasti; Malattie dell'osso
Osteopetrosis; Hurler Syndrome; Gene Therapy; Osteoclasts; Malattie dell'osso
MED/05 - PATOLOGIA CLINICA
English
9-feb-2021
MEDICINA TRASLAZIONALE E MOLECOLARE - DIMET
33
2019/2020
open
(2021). Development of novel cell based therapeutic approaches to correct primary and secondary bone defects.. (Tesi di dottorato, Università degli Studi di Milano-Bicocca, 2021).
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