BAFF RECEPTOR (BAFF-R) CAR-REDIRECTED T CELLS: A NOVEL TOOL TO TREAT HIGH RISK B -CELL ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA (B-ALL)

B-cell Acute Lymphoblastic Leukemia (B-ALL) is most common in children (80%), but it has also a peak of incidence in adult age. Recently, immunotherapeutic approaches targeting the CD19 molecule have demonstrated remarkable success in the treatment of relapsed and refractory B-ALL, which remains a major clinical need. Important downsides of these strategies are the emergence of CD19-negative relapses and B-cell aplasia as a result of anti-CD19 CAR T-cell persistence. In this context, we hypothesized that the receptor for B-cell activating factor (BAFF-R), a transmembrane protein fundamental in B-cell maturation and survival, could be an interesting molecule to be targeted, taking the advantage that this receptor is undetectable on bone marrow B-cell precursors. Here we showed that BAFF-R is highly expressed in B-ALL primary samples at the onset and relapse In order to develop a chimeric antigen receptor (CAR) approach targeting BAFF-R molecule, six anti-BAFFR CAR genes that differ for the inversion of the VH and VL and the length of the spacer domain have been generated. Cytokine-induced Killer (CIK) cells, engineered using an improved Sleeping Beauty (SB) transposon system, stably expressed anti-BAFFR.CARs, and maintained their characteristic phenotype. Among the newly constructed CARs, the shortest VHVL CAR exerted the highest anti-leukemic activity towards target cells, such as NALM-6, with an in vitro killing activity of 60%. We also evaluated later effector functions in terms of cytokine release by intracellular staining (8,9±2% of IFN-γ and 16,4±5,5% of IL-2 producing cells). Importantly, we also detected a specific cytotoxic activity towards primary B-ALL blasts (average 65,6±4,5%, n=9). Combining the Invsh.CAR with CD19.CAR we detected a superior antitumor activity towards ALL targets. Furthermore, by using a sample collected from a patient relapsed with CD19 negative disease, we demonstrated the ability of the INVsh.CAR to lysate CD19-negative blasts. Taken together, these findings make this receptor a safe and attractive target for a second line B-ALL immunotherapy in case of relapse after CD19-targeting therapies or for a double targeted approach. Being restricted to mature B cells, but absent in precursors and plasmablasts, our strategy could have an inferior toxicity concerning the emergence of B-cell aplasia observed in patients treated with anti-CD19 CAR-modified T cells.

La leucemia linfoblastica acuta B (LLA-B) è la leucemia più comune nei bambini (80%), ma ha anche un picco di incidenza in età adulta. Recentemente, gli approcci di immunoterapia diretti contro la molecola CD19 hanno dimostrato un notevole successo nel trattamento della LLA-B recidiva e refrattaria, che rimane una delle principali necessità cliniche. Svantaggi importanti di tali strategie sono la comparsa di recidive CD19-negative e aplasia delle cellule B come risultato della persistenza delle cellule anti-CD19 CAR. In questo contesto, abbiamo ipotizzato che il recettore per il fattore di attivazione delle cellule B (BAFF-R), una proteina transmembrana fondamentale nella maturazione delle cellule B e nella loro sopravvivenza, potrebbe essere una molecola interessante per strategie di targeting, avendo come vantaggio il fatto che questo recettore non è rilevabile nelle cellule B precursori del midollo osseo. Nel nostro lavoro abbiamo dimostrato che BAFF-R è altamente espresso in tutti i campioni primari di LLA-B sia all'insorgenza che alla ricaduta. Al fine di sviluppare un approccio mediato da un recettore chimerico (CAR) specifico per l’antigene BAFF-R, sono state sviluppate sei tipologie di CAR anti-BAFFR che si differenziano per l'inversione della VH e VL e la lunghezza del dominio cerniera. Cellule killer indotte da citochine (CIK), ingegnerizzate utilizzando un sistema non virale che sfrutta trasposoni Sleeping Beauty (SB), esprimono stabilmente anti-BAFFR.CARs e mantengono il loro caratteristico fenotipo. Tra i CAR generati, il CAR più breve VHVL esercita la massima attività anti-leucemica verso le cellule bersaglio, come NALM-6, con un'attività citotossica in vitro pari al 60%. Abbiamo valutato anche le funzioni effettrici a lungo termine di rilascio di citochine mediante colorazione intracellulare (8,9 ± 2% di cellule producesti IFN-γ e 16,4 ± 5,5% di cellule producesti IL-2). Inoltre, abbiamo anche rilevato una specifica attività citotossica nei confronti di blasti primari di LLA-B (media 65,6 ± 4,5%, n = 9). Combinando le cellule trasdotte Invsh.CAR con le cellule trasdotte CD19.CAR abbiamo rilevato una attività antitumorale superiore nei confronti di tutti le linee target. Infine, utilizzando un campione raccolto da un paziente con recidiva di malattia negativa per l’antigene CD19, abbiamo dimostrato la capacità del INVsh.CAR di lisare blasti CD19-negativi. Concludendo, questi risultati dimostrano come questo recettore sia un bersaglio sicuro e attraente per un trattamento immunoterapeutico di seconda linea per la LLA-B in caso di recidiva dopo terapia con approcci di targeting dell’antigene CD19 o per un approccio di targeting doppio. Essendo BAFF-R ristretto a cellule B mature e assente in precursori e plasmablast, la nostra strategia potrebbe avere una tossicità inferiore, per quanto riguarda l'emergere di aplasia delle cellule B osservata nei pazienti trattati con le cellule T anti-CD19 CAR.